Методы биохимических исследований белковых молекул. Автор – доцент Рыскина Е.А. - презентация

1 Методы биохимических исследований белковых молекул. Автор – доцент Рыскина Е.А.

2 Методы биохимических исследований В основе биохимической методологии лежит фракционирование, анализ и изучение структуры и свойств отдельных компонентов живого вещества. Методы биохимии преимущественно формировались в XX веке; наиболее распространенными являются: хроматография, изобретенная М.С.Цветом в 1906 г., хроматографияМ.С.Цветом центрифугирование (Т.Сведберг, 1923 г., Нобелевская премия по химии 1926 г.) центрифугирование Сведберг Нобелевская премия по химии электрофорез (А.Тизелиус, 1937 г., Нобелевская премия по химии 1948 г.). электрофорез ТизелиусНобелевская премия по химии

3 Методы разделения и очистки белков Высаливание Диализ Электрофорез Ультрацентрифугирование Хроматографические методы: Гель – фильтрация или метод молекулярных сит Ионообменная хроматография Аффинная хроматография и др.

4 Высаливание Суть метода состоит в том, что растворимость белка может изменяться при разной концентрации соли или другого осадителя, а также при изменение рН. Такой осадитель разрушает гидратную оболочку белка, падает растворимость белка в воде и он выпадает в осадок. Осадителями могут быть: сульфата аммония – (NН4) 2 SО 4, ацетон, спирт. Изменение растворимости при различных концентрациях соли и рН среды используются для выделения индивидуальных белков. Чаще всего используют разные концентрации соли сульфата аммония – (NН4) 2 SО 4

5 Диализ Диализ освобождение коллоидных растворов и растворов высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны.коллоидных растворовполупроницаемой мембраны При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) высокомолекулярных соединения остаются в растворе. Материал, прошедший через мембрану, называется диализат.мембрану

6 Ультрацентрифугирование метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений с помощью ультрацентрифуги. Метод заключается в том, что белки в пробирке помещают в ультрацентрифуги. При враще­нии ультрацентрифуги скорость оседания белков пропорцио­нальна их молекулярной массе: более тяжелые бел­ки образуют фракции, расположенные ближе ко дну кюветы, более легкие к поверхности.

7 Простейший диализатор Представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель (например в воду). Постепенно концентрации диализирующего вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей.коллодия

8 Электрофорез. Электрофорез основан на свойстве заряженных молекул белка перемещаться в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду и молекулярной массе. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), форма и электрический заряд. Причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

9 Электрофорез белков Под действием электрического поля макромолекулы белка в соответствии со своим суммарным зарядом и массой мигрируют в направлении катода или анода. Электрофорез проводят на носителях: бумаге, геле и т.д. Электрофорез на бумаге – скорость миграции белка зависит от заряда; Электрофорез в геле - скорость миграции зависит от молекулярной массы. Для обнаружения белковых фракций бумагу или гель обрабатывают красителем. Окрашенный комплекс белков выявляет расположение различных фракций на носителе.

10 Электрофорез в полиакриламидном геле Предварительно белки денатурируют с тем, чтобы скорость миграции зависела только от молекулярной массы. Для этого анализируемую смесь обрабатывают додецилсульфатом натрия (ДСН), который представляет собой детергент с сильно выраженными амфифильными свойствами. Развернутые полипептидные цепи связывают ДСН и приобретают отрицательный заряд. Электрофорез проводят в тонком слое геля. После завершения электрофореза, зоны белков выявляют c помощью красителя. Фотография полиакриламидного геля, иллюстрирующая разделение белков по молекулярной массе. Маркеры на левой дорожке.

11 Хроматография метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель- фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Класcификация видов хроматографии по механизму взаимодействия: Распределительная хроматография Ионообменная хроматография Адсорбционная хроматография Аффинная хроматография Гель – фильтрация и др. Хроматография (от греч. χρ μα цвет)

12 Распределительная хроматография Один из типов распределительной хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве неподвижной фазы применяют влажный крахмал или силикагель.хроматографиикрахмал силикагель Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку. Разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.растворителевещества растворителя При помощи коллектора фракций можно собрать пробы. Одна проба содержит одно вещество, которое можно выделить в чистом виде. пробывещество

13 Распределительная хроматография

14 Распределительная хроматография на бумаге Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге. Она оказалась наиболее доступной для разделения аминокислот, отличающихся гидрофобностью радикалов.хроматографиихроматография на бумаге В качестве неподвижной фазы служит вода, а подвижной - смесь органических растворителей (например, бутанол– уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в смесь, при движении растворителя по бумаге происходит разделение компонентов смеси. Хроматограмму проявляют и высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

15 Хроматография на бумаге А – восходящая хроматография; Б – нисходящая хроматография (вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

16 Ионообменная хроматография Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядов разделяемых молекул. Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные белки, малыемолекулы нуклеотидов и аминокислот. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии классифицируется на два типа катионную и анионную ионообменную хроматографию.

17 Ионообменная хроматография В зависимости от заряда разделяемых веществ используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть соединений, в то время как другие беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке вещества снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

18 Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы полимера, несущие сульфогруппы ( SО 3 -). Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд. Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na+ -содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа (красный цвет) связывает ионы натрия. Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот (1 а), то положительно заряженные аминокислоты (зеленый цвет) вытеснят ионы натрия и будут сорбированны на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их элюируют с колонки буфером с более высоким значением рН (1 б). В качестве примера приведен эксперимент (3) по разделению аспарагиновой кислоты, треонина и гистидина. Графики титрования (2) наглядно объясняют, почему три аминокислоты элюирутся в указанной последовательности. Строго говоря, аминокислоты элюируются при величинах рН, значительно ниже изоэлектрических точек, поскольку за связывание с ионообменником конкурируют Na+-ионы буферного раствора.

19 Смесь аминокислот разделяют в колонке с катионообменной смолой, которая содержит прочно связанные с ней отрицательно заряженные группы (например, остатки сульфоновой кислоты -SO3-), к которым присоединены ионы Na+. В катионообменник вносят смесь аминокислот в кислой среде (рН 3,0), где аминокислоты в основном представляют катионы, т.е. несут положительный заряд. Положительно заряженные аминокислоты присоединяются к отрицательно заряженным частицам смолы. Чем больше суммарный заряд аминокислоты, тем прочнее её связь со смолой. Так, аминокислоты лизин, аргинин и гистидин наиболее прочно связываются с катионообменником, а аспарагиновая и глутаминовая кислоты - наиболее слабо. Высвобождение аминокислот из колонки осуществляют вымыванием (элюированием) их буферным раствором с увеличением концентрации NaCl и рН. При увеличении рН аминокислоты теряют протон, в результате уменьшается их положительный заряд, а следовательно и прочность связи с отрицательно заряженными частицами смолы. Каждая аминокислота выходит из колонки при определённом значении рН и ионной силы. Собирая с нижнего конца колонки раствор (элюат) в виде небольших порций, можно получить фракции, содержащие отдельные аминокислоты.

20 Адсорбционная хроматография.хроматография Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте.адсорбенте В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.адсорбентов древесный угольгельфосфата кальцияоксиды алюминиякремния Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в колонку и равномерно в ней упаковывают. Адсорбентсуспензиирастворителембуферным раствором Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте.растворителяадсорбенте Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты.десорбции Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

21 Аффинная хроматография Наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на взаимодействии белков с лигандами, прикрепленными (иммобилизированными) к твердому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент. Через колонку, заполненную лигандом, пропускают смесь белков. К лиганду присоединяется только белок специфично взаимодействующий с ним, все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно смыть раствором с измененным рН или ионной силы.

22 Гель - фильтрационная хроматография (ситовая, гель- проникающая) Разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

23 Гель-хроматография Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.

24 Методы разделения АМК Ионообменная хроматография Хроматография на бумаге Электрофорез

25 Какими методами можно разделить : Гексапептид и белок - по молекулярной массе или по заряду разными методами. Альбумин и продукты его гидролиза можно разделить по молекулярной массе и суммарному заряду (гель – фильтрацией, электрофорезом и ионообменной хроматографией).

26 Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка высаливанием Называется процесс выделения белков из водных растворов нейтральными растворами концентрированных солей щелочных и щелочноземельных металлов. При добавлении больших концентраций солей к раствору белка происходит дегидратация белковых частиц и снятие заряда; при этом белки выпадают в осадок. Степень в ыпадения белков в осадок зависит от ионной силы раствора осадителя, размера частиц белковой молекулы, величины ее заряда, гидрофильности. Разные белки осаждаются при различных концентрациях солей. Поэтому в осадках, полученных путем постепенного повышения концентрации солей, отдельные белки находятся в различных фракциях. Высаливание белков является обратимым процессом, и после удаления соли белок вновь приобретает природные свойства. Поэтому высаливанием пользуются в клинической практике при разделении белков сыворотки крови, а также при изолировании и очистке различных белков. Исследуемый материал: яичный белок. Реактивы: насыщенный раствор (NH4)2SO4, измельченный порошок (NH4)2SO4, 10 %- ный раствор NaOH, 1 %-ный раствор CuSO4 Ход работы. В пробирку наливают 20 капель неразведенного яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, содержимое перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок – яичный альбумин. Для высаливания альбумина к фильтрату добавляют измельченный порошок сульфата аммония до полного насыщения, то есть до тех пор, пока не прекратится растворение соли. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.