ЗАО «ЭКОлаб» лабораторная диагностика сифилиса Амелина Е.А. начальник отдела перспективных разработок, К.Б.Н. - презентация

1 ЗАО «ЭКОлаб» лабораторная диагностика сифилиса Амелина Е.А. начальник отдела перспективных разработок, К.Б.Н.

2 Динамика заболеваемости сифилисом в Российской Федерации ( гг.) [на 100 тыс.населения]

3 Динамика заболеваемости сифилисом по федеральным округам РФ ( гг.) [на 100 тыс. населения ]

4 Заболеваемость сифилисом в странах Европы [на населения] 2008 г. Заболеваемость сифилисом в странах Европы [на населения] 2008 г.

5 Перераспределение в структуре скрытого сифилиса с возрастанием Перераспределение в структуре скрытого сифилиса с возрастанием эпидемически опасных ранних форм инфекции эпидемически опасных ранних форм инфекции Рост осложнений: мертворождения, врождённый сифилис, нейросифилис, третичный сифилис, серорезистентность Рост осложнений: мертворождения, врождённый сифилис, нейросифилис, третичный сифилис, серорезистентность Оседание в стационарах соматического профиля до 30-32% от всех зарегистрированных случаев Оседание в стационарах соматического профиля до 30-32% от всех зарегистрированных случаев

6 Серологические исследования являются в настоящее время основным элементом клинической лабораторной диагностики сифилиса. Они решают три задачи: скрининг на сифилис; диагностика сифилиса при наличии подозрений на него; контроль эффективности лечения диагностированного сифилиса

7 Методы диагностики сифилиса Прямые Темнопольная микроскопия Прямая иммуно- флюоресценция ПЦР Непрямые (серологические) Нетрепонемные тесты Трепонемные тесты 8 Окончательный диагноз Предварительный диагноз

8 ПЦР-исследование наT.pallidum Все ПЦР – тесты собственного производства перед использованием должны быть апробированы путем тестирования: Все ПЦР – тесты собственного производства перед использованием должны быть апробированы путем тестирования: не менее 10 образцов от больных сифилисом, положительных в методе ТПМ (образец) с положительными серореакциями (кровь) не менее 10 образцов от больных сифилисом, положительных в методе ТПМ (образец) с положительными серореакциями (кровь) не менее 10 образцов от пациентов, у которых в методе ТПМ (образец)и при серологическом исследовании (кровь) получен отрицательный результат не менее 10 образцов от пациентов, у которых в методе ТПМ (образец)и при серологическом исследовании (кровь) получен отрицательный результат В настоящее время ПЦР для диагностики сифилиса имеет исследовательский статус В настоящее время ПЦР для диагностики сифилиса имеет исследовательский статус

9 тесты Нетрепонемные тесты Сифилис VDRL –тест (Veneral Disease Research Laboratory) Рекомендован к применению ВОЗ Микрофлокуляционный тест на основе кардиолипинового антигена Применение микроскопа с Х100 позволяет рассмотреть микрокомплексы АГ-АТ Исследование образцов cмж редко даёт ложноположительный результат в отличие от исследования инактивированной сыворотки Традиционный диагностический тест для постановки диагноза нейросифилиса Мониторинг эффективности лечения

10 РИФ – реакция иммунофлуоресценции (FTA Fluorescent treponemal antibody) набор реагентов для определения антител к антигенам T.pallidum Сифилис-IgG-РИФ и Сифилис-IgM-РИФ

11 Рекомендации по применению отдельных ТТ РИФ (в особенности РИФабс ) считается наиболее чувствительным тестом на сифилис и принята в качестве «золотого стандарта» среди ТТ. Чувствительность при первичном сифилисе %, при вторичном и позднем %, специфичность – % Показания к применению: «золотой стандарт» Показания к применению: «золотой стандарт» подтверждающего теста на сифилис подтверждающего теста на сифилис Ограничения применения: Ограничения применения: не может использоваться при скрининге ввиду трудоемкости ручной методики исследования, необходимости использования флуоресцентного микроскопа, субъективности оценки результатов теста не может использоваться при скрининге ввиду трудоемкости ручной методики исследования, необходимости использования флуоресцентного микроскопа, субъективности оценки результатов теста

12 Трепонемные тесты ИФА-Антипаллидум-скрин ИФА-Антипаллидум-одностадийный ИФА-Антипаллидум-IgG (Аналитическая чувствительность методов–0,01- 0,02 МЕ/мл) ИФА-Антипаллидум-IgM Сифилис РПГА-тест (Аналитическая чувствительность метода –0,05МЕ/мл) Все системы контролируются международным стандартом ВОЗ(NIBS, London, UK) для выпуска с одинаковой аналитической чувствительностью всех серий

13 ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности проведенной специфической терапии, так как антитрепонемные антитела могут длительно циркулировать в организме больного, перенесшего сифилитическую инфекцию Дают положительные результаты при тропических трепонематозах (фрамбезия - вызывается T.pertenue и пинта - вызывается T.carateum) Могут давать ложные положительные реакции у больных с аутоиммунными заболеваниями, проказой, онкологической и эндокринной патологией, а также и при некоторых других заболеваниях и состояниях Ограничения применения ТТ

14 Лайн-Блот Сифилис Вариант иммуноферментного анализа в формате линейного блота для регистрации антител к наиболее иммуногенным детерминантам Вариант иммуноферментного анализа в формате линейного блота для регистрации антител к наиболее иммуногенным детерминантам

15 Расположение антигенов в Лайн Блот Сифилис Контроли Контроли Антигены TpN47 TpN17 TpN15 TmpA ± Контроль А/г

16 Принцип технологии иммуноблоттинга Иммобилизация на нитроцеллюлозную мембрану рекомбинантных белков - аналогов антигенов Treponema pallidum p17, p 47, p 41, p15 Иммобилизация на нитроцеллюлозную мембрану рекомбинантных белков - аналогов антигенов Treponema pallidum p17, p 47, p 41, p15 Проведение иммуноферментного анализа для Проведение иммуноферментного анализа для одновременного дифференцированного выявления антител к каждому из нанесённых на мембрану антигенов одновременного дифференцированного выявления антител к каждому из нанесённых на мембрану антигенов Антитела к белкам T. pallidum в разной степени Антитела к белкам T. pallidum в разной степени регистрируются на всех стадиях инфекции регистрируются на всех стадиях инфекции Выявлена зависимость появления антител к различным белкам на разных стадиях инфекции Выявлена зависимость появления антител к различным белкам на разных стадиях инфекции

17 Оценка интенсивности антителообразования к белкам T.pallidum у больных сифилисом Условные ед. «+»

18 Интенсивность антителообразования к белкам T.pallidum у пациентов после перенесенного сифилиса стадия заболевания Условные ед. «+»

19 Реактивность сыворотки оценивают по каждому антигену отдельно, путём сравнения интенсивности окрашивания полученных полос с окрашиванием трёх калибровочных линий Реактивность сыворотки оценивают по каждому антигену отдельно, путём сравнения интенсивности окрашивания полученных полос с окрашиванием трёх калибровочных линий Отслеживание белкового профиля помогает при уточнении стадии инфекции и в оценке эффективности Отслеживание белкового профиля помогает при уточнении стадии инфекции и в оценке эффективности проведённого лечения проведённого лечения

20 Частота выявления антител к основным иммунореактивным белкам Tr.Pallidum TpN15 – 67,5% TpN15 – 67,5% TpN17 – 98,5% TpN17 – 98,5% TmpA – 95,0% TmpA – 95,0% TpN47 – 92,5% TpN47 – 92,5% За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью ( 99,6-100%) и специфичностью (100%), что позволяет рассматривать его как новый подтверждающий тест на сифилис. За счет высокой степени очистки рекомбинантных антигенов и одновременного выявления антител к наиболее иммуногенным детерминантам возбудителя сифилиса метод обладает высокой чувствительностью ( 99,6-100%) и специфичностью (100%), что позволяет рассматривать его как новый подтверждающий тест на сифилис.

21 Применение метода иммуноблоттинга целесообразно: Для ранней диагностики сифилиса. В возможном инкубационном периоде и при первичном сифилисе Для ранней диагностики сифилиса. В возможном инкубационном периоде и при первичном сифилисе Для подтверждения диагноза скрытого раннего сифилиса ( при противоречивых результатах традиционных серологических методов) Для подтверждения диагноза скрытого раннего сифилиса ( при противоречивых результатах традиционных серологических методов) При необходимости проведения дифференциальной диагностики с л/положительными результатами серологических реакций на сифилис, особенно, при аутоиммунных заболеваниях: ревматизме,СКВ При необходимости проведения дифференциальной диагностики с л/положительными результатами серологических реакций на сифилис, особенно, при аутоиммунных заболеваниях: ревматизме,СКВ В сложных диагностических ситуациях, как референс- метод. В сложных диагностических ситуациях, как референс- метод. При оценке результатов лечения При оценке результатов лечения При необходимости установления ретроспективного диагноза. При необходимости установления ретроспективного диагноза. 21

22 Основные характеристики : Общее время постановки - 2ч 45 мин Необходимый объем сыворотки (плазмы) или ликвора – 20 мкл. Срок годности набора – 12 месяцев. Число определений, включая контрольные образцы –24 Специфичность и чувствительность при оценке на сыворотках панелей МБС – 100 %. Преимущества: Действует принцип: «Один пациент – одна тест-полоска – один результат» Возможность тестирования образцов ликвора Все компоненты тест-системы - окрашенные жидкие реагенты -готовы к использованию и не требуют дополнительного разведения Возможность проведения реакции ИБ c использованием анализаторов.

23 Автоматическая станция ProfiBlot 48 для исследования в иммуноблоттинге

24 Основные направления развития диагностики сифилиса Автоматизация и объективизация выполнения исследований Автоматизация и объективизация выполнения исследований (роботизированные (роботизированные станции, фотометры)

25 Спасибо за внимание !