Биообъекты: способы их создания и совершенствования. 1.1 Понятие «Биообъект» БО Биообъект – центральный и обязательный элемент биотехнологического производства, - презентация

1 Биообъекты: способы их создания и совершенствования. 1.1 Понятие «Биообъект» БО Биообъект – центральный и обязательный элемент биотехнологического производства, определяющий его специфику. Продуцент полный синтез целевого продукта, включающий ряд последовательных ферментативных реакцийБиокатализатор катализ определенной ферментативной реакции (или каскада), которая имеет ключевое значение для полученияцелевого продукта катализ определенной ферментативной реакции (или каскада), которая имеет ключевое значение для получения целевого продукта По производственным функциям:

2 2 Биообъект как участник технологического процесса макро-био-объекты (человек, животные, растения): высокоорганизованные живые системы, пластично приспособлены к абсолютно автономному существованию в условиях внешней среды получение биомассы (ткани, биожидкости, клетки) происходит в природных условиях (плантационное культивирование ЛР, разведение змей, пчел, пиявок). микро-био-объекты не способны к автономному существованию во внешней среде, необходимо создать техногенную экологическую нишу для обеспечения: 1.условий для существования био-объекта в монокультуре; 2.экономически целесообразных темпов функционирования для получения необходимого количества биомассы; 3.защиты культуры-продуцента от внешних неблагоприятных факторов; 4.защиты культуры-продуцента от контаминации патогенной микрофлорой (лизогенный фаг для коклюшных бактерий, онкогенные вирусы для вируса полиомиелита); 5.защиты окружающей среды от выбросов патогенных штаммов- продуцентов (при получении ксантана фитопатогенный Xantomonas campestic, при получении витамина В2 гриб Eremothecium – паразит хлопчатника).

3 Биообъекты 1) Макромолекулы: ферменты всех классов (чаще гидролазы и трансферазы); –в т.ч. в иммобилизированном виде (связанные с носителем) обеспечивающем многократность использования и стандартность повторяющихся производственных циклов ДНК и РНК – в изолированном виде, в составе чужеродных клеток 2) Микроорганизмы: вирусы (с ослабленной патогенностью используются для получения вакцин); клетки прокариоты и эукариоты –продуценты первичных метаболитов: аминокислот, азотистых оснований, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов для заместительной терапии и т.д.); –продуценты вторичных метаболитов:антибиотики, алкалоиды, стероидные гормоны, и др. нормофлоры – биомасса отдельных видов микроорганизмов применяемые для профилактики и лечения дисбактериозов возбудители инфекционных заболеваний – источники антигенов для производства вакцин трансгенные м/о или клетки – продуценты видоспецифичных для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т. д. 3) Макроорганизмы высшие растения – сырье для получения БАВ ; Животные - млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие, рыбы, моллюски, человек Трансгенные организмы

4 Цели совершенствования БО: (применительно к производству) - увеличение образования целевого продукта; - снижение требовательности к компонентам питательных сред; - изменение метаболизма биообъекта, например снижение вязкости культуральной жидкости; - получение фагоустойчивых биообъектов; - мутации, ведущие к удалению генов, кодирующих ферменты. Методы совершенствования БО: Селекция спонтанных (природных) мутаций Индуцированный мутагенез и селекция Клеточная инженерия Генетическая инженерия

5 Селекция и мутагенез Спонтанные мутацииСпонтанные мутации –встречаются редко, –разброс по степени выраженности признаков невелик. индуцированный мутагенез: разброс мутантов по выраженности признаков больше. разброс мутантов по выраженности признаков больше. появляются мутанты с пониженной способностью к реверсии, т.е. со стабильно измененным признаком появляются мутанты с пониженной способностью к реверсии, т.е. со стабильно измененным признаком селекционная часть работы - отбор и оценка мутаций: Обработанную культуру рассеивают на ТПС и выращивают отдельные колонии (клоны) клоны сравнивают с исходной колонией по разным признакам: -мутанты, нуждающиеся в конкретном витамине, или аминокислоте; -мутантны, синтезирующие фермент расщепляющий определенный субстрат; -антибиотикорезистентные мутанты Проблемы суперпродуцентов: высоко продуктивные штаммы крайне нестабильны вследствие того, что многочисленные искусственные изменения в геноме не связаны с жизнеспособностью. мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: популяцию клеток высеивают на твердую среду и полученные из отдельных колоний культуры проверяют на продуктивность.

6 Совершенствование биообъектов методами клеточной инженерии Клеточная инженерия – «насильственный» обмен участками хромосом у прокариот или участками и даже целыми хромосомами у эукариот. В результате создаются неприродные биообъекты, среди которых могут быть отобраны продуценты новых веществ или организмы с ценными в практическом отношении свойствами. Возможно получение межвидовых и межродовых гибридных культур микроорганизмов, а также гибридных клеток между отдаленными в эволюционном отношении многоклеточными организмами.

7 Создание биообъектов методами генетической инженерии Генетическая инженерия –соединение фрагментов ДНК природного и синтетического происхождения или комбинацию in vitro с последующим введением полученных рекомбинантных структур в живую клетку для того, чтобы введенный фрагмент ДНК после включения его в хромосому либо реплицировался, либо автономно экспрессировался. Следовательно, вводимый генетический материал становится частью генома клетки. Необходимые составляющие генного инженера: а) генетический материал (клетку – хозяина); б) транспортное устройство – вектор, переносящий генетический материал в клетку; в) набор специфических ферментов - «инструментов» генной инженерии. Принципы и методы генной инженерии отработаны, прежде всего, на микроорганизмах; бактериях – прокариотах и дрожжах – эукариотах. Цель: получение рекомбинантных белков – решение проблемы дефицита сырья.

8 8 Слагаемые биотехнологического производства Главные особенности БТ производства: 1.два активных и взаимосвязанных представителя средств производства – биообъект и «ферментер»; 2.чем выше темп функционирования биообъекта, тем более высокие требования предъявляются к аппаратурному оформлению процессов; 3.оптимизации подвергают и биообъект и аппараты биотехнологического производства Цели осуществления биотехнологии : 1.основной этап производства ЛС – получение биомассы (сырья, ЛВ); 2.один или несколько этапов производства ЛС (в составе химического или биологического синтеза) - биотрансформация, разделение рацематов и т.п.; 3.полный процесс производства ЛС – функционирование биообъекта на всех стадиях создания препарата. Условия осуществления биотехнологий при производстве ЛП 1.Генетически обусловленная способность био-объекта к синтезу или специфической трансформации связанной с получением БАВ или ЛС; 2.Защищенность био-объекта в биотехнологической системе от внутренних и внешних факторов; 3.Обеспечение функционирующих в биотехнологических системах био- объектов пластическим и энергетическим материалом в объемах и последовательности, гарантирующих нужную направленность и темп биотрансформации.

9 Схема биотехнологического производства Биообъект – это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует присущую ему реакцию.

10 КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ типы продуктов получаемых БТ методами: –интактные клетки –одноклеточные организмы используют для получения биомассы –клетки (в т.ч. иммобилизованные) для биотрансформации. Биотрансформация - реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них. (производство ам-к-т, а/б, стероидов и др.) низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток: –Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. (структурные единицы биополимеров ам-к-ты, нуклеотиды, моносахариды, витамины, коферменты, органические к-ты) –Вторичные метаболиты (а/б, пигменты, токсины) НМС, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста. Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов в процессе роста организма: 1 биомасса; 2 продукт

11 СТРУКТУРА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

12 Стадии БТ производства 1.Подготовка сырья (питательной среды) субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) 2.Подготовка биообъекта: посевной культуры или фермента ( в т.ч. иммобилизованного). 3.Биосинтез, биотрансформация (ферментация) - образование целевого продукта за счет биологического превращения компонентов питательной среды в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. 4.Выделение и очистка целевого продукта. 5.Получение товарной формы продукта 6.Переработка и утилизация отходов (биомассы, культуральной жидкости и т.п.) Основные типы биотехнологических процессов Биоаналогичные Производство метаболитов – химических продуктов метаболической активности, первичные - аминокислоты, полисахариды вторичные - алкалоиды, стероиды, антибиотики Многосубстратные конверсии (обработка сточных вод, утилизация лигноцеллюлозных отходов) Односубстратные конверсии (превращение глюкозы во фруктозу, D-сорбита в L- сорбозу при получении вит С) Биохимические производство клеточных компонентов (ферменты,нуклеиновые кислоты) Биологические Производство биомассы (белок одноклеточных)

13 1.Вспомогательные операции: 1.1. Подготовка посевного материала (инокулята): засев пробирок, качалочных колб (1-3 сут), инокулятора (2-3 % 2-3 сут), посевного аппарата (2-3сут). Кинетические кривые роста 1.индукционный период (лаг-фаза) 2.фаза экспоненциального роста (накопление биомассы и продуктов биосинтеза) 3.фаза линейного роста (равномерный рост культуры) 4.фаза замедленного роста 5.стационарная фаза (постоянство жизнеспособных особей 6.Фаза старения культуры (отмирания ) N t Подготовка питательной среды выбор и реализация рецептуры среды, стерилизация гарантирующая сохранность пластических и энергетических компонентов, в исходном количестве и качестве. Особенностью биообъектов является потребность в многокомпонентных энергетических и пластических субстратах, содержащих О, С, N, Р, Н – элементы необходимые для энергетического обмена и синтеза клеточных структур.

14 Содержание биогенных элементов в различных биообъектах, в % Микро- организмы элемент углеродазотфосфоркислородводород бактерии50,412,34,030,56,8 дрожжи47,810,44,531,16,5 грибы47,95,23,540,46,7 Элементный состав биомассы по химическим элементам позволяет сделать для каждого биообъекта описание Существует количественная закономерность влияния концентрации элементов питательной среды на скорость роста биомассы, равно как и взаимовлияние тех же элементов на удельную скорость роста биообъектов С DN/ dT 123 C – концентрация лимитирующего компонента DN/dT – скорость роста микроорганизмов. 1 -область лимитирования, 2- область оптимального роста, 3 – область ингибирования.

15 1.3. Стерилизация питательной среды необходимо полностью исключить контаминантную флору и сохранить биологическую полноценность субстратов чаще автоклавирование, реже химические и физические воздействия. Эффективность выбранного режима стерилизации оценивают по константе скорости гибели микроорганизмов (берется из специальных таблиц) умноженная на продолжительность стерилизации Подготовка ферментера Стерилизация оборудования острым паром. Герметизация с особым вниманием к «слабым» точкам тупиковые штуцера малого диаметра, штуцера датчиков контрольно-измерительной аппаратуры. Выбор ферментера осуществляется с учетом критериев дыхания биообъекта, теплообмена, транспорт и превращения субстрата в клетке, скорость роста единичной клетки, время ее размножения и т.п.

16 Ферментация – основной этап биотехнологического процесса Ферментация – это вся совокупность операций от внесения микробов в подготовленную и нагретую до необходимой температуры среду до завершения биосинтеза целевого продукта или роста клеток. Весь процесс протекает в специальной установке – ферментере. Все биотехнологические процессы можно разделить на две большие группы - периодические и непрерывные. При периодическом способе производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, часто уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. При непрерывном способе подача равных объемов сырья (питательных веществ) и отвод культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт осуществляется одновременно. Такие ферментационные системы характеризуются как открытые.

17 Методы ферментации Ферментация Глубинная Периодические Твердофазная поверхностная Непрерывная Клетки Суспендированные клетки Иммобилизованные клетки Ферменты Иммобилизованные ферменты Ферменты в растворе

18

19 по объёму: –лабораторные 0, л, –пилотные 100л -10 м3, –промышленные м3 и более. критерии выбора ферментера: –теплообмен, –скорость роста единичной клетки, –Тип дыхания биообъекта, –Вид транспорта и превращения субстрата в клетке –время размножения отдельной клетке. Аппаратурное оформление биотехнологического процесса - ферментеры:

20

21 ферментеры Лабораторный газовихревой Инкубационная качалка Ферментационный цех Производственный

22 Biostat A plus - автоклавируемый ферментер со сменными сосудами (рабочий объем 1,2 и 5 л) для культивирования микроорганизмов и культур клеток и является полностью масштабируемым при переходе к большим объемам. Единый корпус с интергрированным оборудованием измерения и управления, насосами, системой температурного контроля, подачи газа и мотором Ноутбук с заранее установленным Windows совместимым программным обеспечением MFCS / DA для управления процессами ферментации и их документирования Лабораторный (схема)

23 Параметры, влияющие на биосинтез (физически, химические, биологические) 1. Температура 2. Число оборотов мешалки (для каждого м/о (микроорганизмы) – разное число оборотов, разные 2х, 3х, 5-ти ярусные мешалки). 3. Расход подаваемого на аэрацию воздуха. 4. Давление в ферментере 5. рН среды 6. Парциальное давление растворенного в воде кислорода (количество кислорода) 7. Концентрация углекислого газа при выходе из ферментера 8. Биохимические показатели (потребление питательных веществ) 9. Морфологические показатели (цитологические) развитее клеток м/о, т.е. надо следить в процессе биосинтеза за развитием м/о 10. Наличие посторонней микрофлоры 11. Определение в процессе ферментации биологической активности Биосинтез БАВ (биологически активные вещества) в условиях производства

24 2. Основные операции: 2.1. Стадия биосинтеза, где в максимальной степени используются возможности биообъекта для получения лекарственного продукта (накапливается внутри клетки или секретируется в культуральную среду) Стадия концентрирования, одновременно предназначена для удаления баласта Стадия очистки, реализующая за счет повтора однотипных операций или за счет набора различных препаративных приемов (ультрафильтрация, экстракция, сорбция, кристаллизация и т. п) повышение удельной специфической активности лекарственного продукта Стадия получения конечного продукта (субстанции или готовой лекарственной формы) с последующими операциями фасовки и упаковки.

25 Питательная среда Разделение Культуральная жидкость Клетки Концентрирование Выделение и очистка метаболитов Дезинтеграция убитых клеток Биомасса убитых клеток Стабилизация продукта Биомасса живых клеток Обезвоживание Стабилизация продукта Применение Хранение Живой продуктСухой продукт Живой продукт Сухой продукт Живой продукт Сухой продукт Культивирование (ферментация) Подготовка инокулята Схема биотехнологического производства

26 Технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов..

27 Фармацевтические препараты требуют высокой степени чистоты Стоимость очистки тем выше, чем ниже концентрация вещества в клетках. Этапы очистки: 1. Сепарация. 2. Разрушение клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы) 3. Отделение клеточных стенок. 4. Отделение и очистка продукта. 5. Тонкая очистка и разделение препаратов. 27

28 Этапы очистки Этап 1. СЕПАРАЦИЯ - отделение массы продуцента от жидкой фазы. Передвароительно для повышения эффективности может проводиться: изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков или флокуллянтов. СПОСОБЫ СЕПАРАЦИИ 1. Флотация (буквально – плавание на поверхности воды) – разделение мелких частиц и выделение капель дисперсной фазы из эмульсий. Основана на различной смачиваемости частиц (капель) жидкостью (преимущественно водой) и на их избирательном прилипании к поверхности раздела, как правило, жидкость – газ (очень редко: твердые частицы – жидкость). Основные виды флотации: пенная (культуральную жидкость с биомассой микроорганизмов непрерывно вспенивают воздухом, подаваемым снизу вверх под давлением, клетки и их агломераты «прилипают» к пузырькам тонкодиспергированного воздуха и всплывают вместе с ними, собираясь в специальном отстойнике) масляная пленочная. 28

29 СПОСОБЫ СЕПАРАЦИИ 2. Фильтрация - используется принцип задержки биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Используются фильтры: однократного и многократного использования; периодического и непрерывного действия (с автоматическим удалением слоя биомассы, забивающего поры); барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные фильтры. 29

30 3. Физическое осаждение. Если биомасса содержит заметных количеств целевого продукта, она осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно. 4. Центрифугирование. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы с образованием 2 фракций: биомассы (твердая) и культуральной жидкости. «-»: необходимо дорогостоящее оборудование; «+»: позволяет максимально освободить культуральную жидкость от частиц; Цетрифугирование и фильтрация могут проходить одновременно в фильтрационных центрифугах. Высокоскоростное центрифугирование разделяет клеточные компоненты по размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. 30 СПОСОБЫ СЕПАРАЦИИ

31 Этап 2. РАЗРУШЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ОБОЛОЧЕК (ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ БИОМАССЫ) Стадия используется, если искомые продукты находятся внутри клеток продуцента. МЕТОДЫ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ механические, химические комбинированные. Физические методы - обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание- оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления). «+»: экономичность методов. «-»: неизбирательность методов, обработка может снижать качество получаемого продукта. 31

32 МЕТОДЫ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ Химические и химико-ферментативные методы - клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. «+»: более высокая избирательность методов Примеры: -клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтерауксусной кислоты или других детергентов, -клетки дрожжей – зимолиазой улитки, ферментами грибов, актиномицетов. 32

33 ЭТАП 4. ОТДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОДУКТА Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или из гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции илииадсорбции. Осаждение: физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование); химическое (с помощью неорганических и органических веществ - этанол, метанол, ацетон, изопропанол). Механизм осаждения органическими веществами: снижение диэлектрической постоянной среды, разрушение гидратного слоя молекул. Высаливание: Механизм высаливания: гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Реагенты: сульфат аммония, сульфаты натрия, магния, фосфат калия. 33

34 Экстракция – процесс избирательного извлечения одного или нескольких растворимых компонентов из твердых тел и растворов с помощью жидкого растворителя – экстрагента. Типы экстракции: Твердо-жидкостная (вещество из твердой фазы переходит в жидкую) - например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин Жидко-жидкостная (вещество переходит из одной жидкости в другую (извлечение антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов). Экстрагенты: фенол, бензиловый спирт, хлороформ, жидкий пропанили бутан и др. Способы повышения эффективности экстракции: повторная экстракция свежим экстрагентом; выбор оптимального растворителя; нагревание экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости; понижением давления в аппарате для экстракции. Для экстракции хлороформом в лабораторных условиях используется аппарат «Сокслет», что позволяет многократно использовать растворитель. 34

35 ЭТАП 4. ОТДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОДУКТА (продолжение) Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент является твердым телом - идет по ионообменному механизму. Адсорбенты: иониты на основе целлюлозы: катионит – карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); анионит – диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), сефадексы на основе декстрана и т.д. 35

36 МЕТОДЫ ТОНКОЙ ОЧИСТКИ И РАЗДЕЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ Хроматография (от греч. chroma – цвет, краска и -графия) – физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Виды хроматографии по технике выполнения: колоночная - разделение веществ проводится в специальных колонках плоскостная: -тонкослойная (ТСХ) – разделение проводится в тонком слое сорбента; -бумажная – на специальной бумаге. 36

37 Для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов применимы: аффинная преципитация - лиганд прикрепляют к растворимому носителю, при добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. аффинное разделение - основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера – наиболее высокоэффективный из аффинных методов очистки. Гидрофобная хроматография основана на связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхности белковой глобулы. Система аффинной очистки рекомбинтных белков Profinia. 37

38 Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Модификацией метода является электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) 38 Gel electrophoresis is a common method for separating protein or DNA Гель-электрофорез - распространенняй метод разделения белков или ДНК