Константин.А. Мирошников Лаборатория молекулярной биоинженерии Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Петлевая. - презентация

1 Константин.А. Мирошников Лаборатория молекулярной биоинженерии Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Петлевая изотермическая амплификация ДНК (LAMP) в молекулярной диагностике

2 Амплификация ДНК in vitro. Полимеразная цепная реакция Kary Mullis Нобелевский Лауреат 1993

3 Полимеразная цепная реакция. Развитие метода и приложения. 1.Молекулярное клонирование. Реком- бинантные продукты генов 2.Определение последовательности ДНК. NextGen sequencing 3.Молекулярная диагностика (патогены, мутации, генетические модификации) 1.Миниатюризация реакции 2.Специализированные ферменты 3.Детекция в реальном времени 4.Дискретные реакции (nested PCR, polony PCR, digital PCR, multiplex PCR) 5.Автоматизация пробоподготовки, протокола реакции и детекции

4 Молекулярная диагностика патогенов. 1.Культуральные методы 2.Иммунологические методы (ELISA) 3.ПЦР-диагностика 4.Биосенсоры 5.Масс-спектрометрия 6.Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот 1.Точное термоциклирование. Дорогое оборудование 2.Чувствительность полимераз к загрязнениям. Сложная пробоподготовка 3.Затрачиваемое время (несколько часов) 4.Квалификация персонала. Применяемые/перспективные методы Недостатки ПЦР

5 Изотермическая амплификация ДНК -Хеликазо-зависимая амплификация (HAD, SIAC). -Амплификация по принципу «катящегося кольца» (Rolling circle amplification, RCA) -Гибридизационная амплификация -Амплификация с замещением цепи (SDA) -Nickase (эндонуклеазно-полимеразная реакция) -Петлевая амплификация (LAMP)

6 Loop-mediated Isothermal AMPlification (LAMP)

7

8 Молекулярные характеристики LAMP Фермент: большая субъединица ДНК полимеразы Bacillus stearothermophilus (Bst- polymerase) Eiken, NEB, 3M; Geobacillus spp polymerase (Optigene) Реакция более специфична к последовательности матрицы (4-6 праймеров vs 2 у ПЦР) Выход реакции в раз (в зависимости от метода детекции) выше, чем у ПЦР - чувствительность Время реакции мин vs 2-3 часа ПЦР RT стадия и LAMP в одной пробирке Меньшая чувствительность к загрязнениям и сторонним нуклеиновым кислотам

9 Аппаратурное оснащение LAMP Приборы на базе термоблока (не требуется точного термоциклирования) Проведение реакции возможно в водяной бане, градуированной микроволновой печи и химическом термопакете Качественное определение результата возможно визуально и с помощью бытовых сканнеров Genie III (Optigene) Isothermal detection(3M) OC Sensor (Eiken)

10 Методы детекции LAMP 1.Визуализация продуктов реакции электрофорез + окрашивание бромидом этидия/нитратом серебра 2.Флуоресцентная детекция в растворе интеркалирующими агентами (SybrGreen, PicoGreen,Yo- Pro-Iodide, PicoGreen) - Optigene

11 Методы детекции LAMP - II 1.Турбидиметрическая визуализация – образование нерастворимого пирофосфата 2.Турбидиметрия + флуоресценция. Calcein/Naphtol Blue с пирофосфатом магния – Eiken 3.BART - Турбидиметрия + люминесценция – 3М

12 Методы детекции LAMP - III 1.Электрохимическое определение продуктов 2.Реакция биотин-СТР- продуктов с Nanogold- частицами 3.Surface Plasmon Resonance 4.Флуоресцентно-меченые праймеры

13 Разработанные диагностические приложения Коммерческие наборы: Escherichia coli, Listeria, Salmonella (3М) Mycobacterium, Legionella, Vibrio cholerae, Campylobacter (Eiken) Экспериментальные разработки: -более 100 вирусов человека, животных и растений, -более 100 видов бактерий (включая генотипирование) -простейшие паразиты (токсоплазма, малярийный плазмодий, эймерия, бабезия, амеба) -Нуклеотидный полиморфизм -Детекция GMP-маркеров

14 Попытки сертификации LAMP-диагностики 1061 пациент в Индии, Вьетнаме,Уганде и Перу МетодТочностьСтоимость LAMP (Eiken)97,8%$10,48 Мазок флуоресц.мик роскопия 94,2%$6,85 PCR (Amplicor MTB Roche) 98,0$12,2

15 Дальнейшее развитие метода Миниатюризация реакции (биочипы, микрофлюидные картриджи) LAMP/детекция на твердой подложке Lateral flow наборы Мультиплексные приложения Совершенствование ферментов и методов детекции

16 СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!