С.А. Попов зав. лабораторией микробиологии НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Москва, 12-05-2011 Использование иммунохроматографического. - презентация

1 С.А. Попов зав. лабораторией микробиологии НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Москва, Использование иммунохроматографического экспресс-теста для идентификации микобактерий туберкулезного комплекса после выращивания на жидких и плотных питательных средах

2 Туберкулез, г. Москва в/выявленные, всего в/выявленные, МБ+ активные ТБ, всего активные ТБ, МБ+ Основные эпидемиологические показатели, абс. значения Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

3 Объемные показатели исследований, г. Москва, 2009 г. Посевов диагностических – 40 тыс. Посевов для контроля лечения – 62 тыс. Посевов ускоренной диагностики – 28 тыс. Выявляется культур МБ – 8,3 тыс. нуждаются в первичной идентификации – 8,3 тыс. нуждаются в видовой дифференциации 8,3 тыс. Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

4 Этапы идентификации микобактерий туберкулеза Первичная идентификация (культуральные характеристики) длительность роста на средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивой окраски; температура роста. Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

5 Этапы идентификации микобактерий туберкулеза Дифференциация МБТ от НТМБ (биохимические и рост на селективных средах) способность продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); наличие нитратредуктазы; наличие термостабильной каталазы; рост на среде с натрием салициловокислым; рост на среде с пара-нитробензойной кислотой; рост на среде с хлоридом натрия. Исключения: M.simae, M.gastri, M.marinum, M.terrae Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

6 Колонии микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена 6

7 Систематическое положение микобактерий и проблемы идентификации МБТ На 2008 г описано более 120 видов микобактерий, из них 7 относятся к комплексу видов M.tuberculosis Порядок Actinomycetales Семейство Mycobacteriaceae Род Mycobacterium Основные проблемы идентификации МБТ: Классические методы – длительность (30 дн.) Молекулярно генетические – трудозатратность (3-4 дн.) Иммунологические – низкая специфичность (

8 Клинические аспекты идентификации Идентификация микобактерий туберкулеза (28 дней) сдерживает передачу результатов ускоренных методов диагностики лекарственной устойчивости МБТ Бактек-960 общей производительностью 8 тыс. иссл./год Средняя длительность тестов на ЛЧ 7-9 дней Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

9 Фундаментальные исследования МБТ Из 33 специфических белков, отличается тем, что секретируется во внешнюю среду, являясь индикатором роста М.tuberculosis. Белок MPT64 - предоминантный белок, массой 24 kDa, обладает иммуногенным свойством. Предложен как потенциальный кандидат состава вакцины, (распознается T-лимфоцитами CD4+). позволили выявить видоспеци-фичный белок AgMPT64 Карта генома М.tuberculosis H37Rv, Nature, 1998 Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

10 Микро-ммунохроматографический тест Конъюгат: конъюгат коллоидного золота и мышиных моноклональных антител к МРТ64 (0,24±0,048 мкг); Тестовая полоса (Т): мышиные моноклональные антитела к МРТ64 (0,32±0,064 мкг) Контрольная полоса (С) : антитела козы к иммуноглобулинам G мыши (0,64±0,128 мкг) Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

11 Процедура проведения теста РЕЗУЛЬТАТРЕЗУЛЬТАТ Колония с плотной среды 100 мкл буфера Перемешать Конденсат с среды (Агар) 100 мкл буфера Жидкая среда 100 мкл взвеси жидкой среды МБТ НТМБ Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

12 Список проверенных видов НТМБ Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

13 Бактерии 68 видов 137 штаммов Грибы 8 видов 15 штаммов Нетуберкулезные МБ 40 видов 57 штаммов 51 клин. культур Список проверенных видов микроорганизмов Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

14 Аналитическая чувствительность теста SD MPT64 Разведения1,01:101:30 Результат теста интенсивность окраски Штаммы МБ H37Rv3+1+0/1+ BCG3+1+0/1+ штаммы МБТ и M.bovis в различных разведениях относительно Ст.мутн.5 (5*10 8 микр. тел) Результат реакции – интенсивность окраски в баллах от 1+ до 3+ = 1*10 5 КОЕ/мл, при снятии с плотной питательной среды ЛЙ Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

15 Аналитическая чувствительность теста SD MPT64 Дополнительное культивирование в час. 0 5*10 5 м. т./мл 24 2*10 6 м. т./мл 48 8*10 6 м. т./мл Результат тестаИнтенсивность реакции Штаммы МБH37Rv BCG штаммы МБТ и BCG с разной длительностью культивирования после индикации роста в системе Бактек-960 в баллах окраски 5*10 6 микр. тел/мл, жидкая питательная среда MGIT, Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

16 Диагностическая чувствительность теста, чистая культура МБТ, плотные п/среды M.tuberculosis, музейные штаммы MDR / XDR клинические изоляты Всего Пительные средыФинн2Л-ЙФинн2Л-Й Положительные Отриц Общее Чувствительность 100% Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

17 Диагностическая специфичность метода, чистые культур НТМБ, плотные п/среды НТМБ 1 музейные штаммы 2 клинические изоляты Всего Пительные средыФинн2Л-ЙФинн2Л-Й Положительные Отриц Общее Специфичность 100% 1,2 M.avium, 1,2 M.kansasii, 1 M.flei, 1 M.scrofulaceum, 1,2 M.fortuitum, 1 M.simae, 1,2 M.intracellularae, Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

18 Диагностическая чувствительность метода, культуры МБТ, среда MGIT Бактек-960 Штаммы / изоляты микроорганизмов музейные, MDR / XDR Клинические Всего чистые культуры контаминиро- ванные Положитель-ные Отриц. 01*2*0 Общее Чувствитель-ность 100%98,5%93% * Недостаточное время дополнительного культивирования Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

19 Диагностическая специфичность метода, культуры НТМБ, среда MGIT Бактек-960 Штаммы микроорганизмов 1 НТМБ, музейные 2 НТМБ, клинич. Бактери- альные Грибко-вые Всего Положительные Отриц Общее Специфичность 100% 1,2 M.avium, 1,2 M.kansasii, 1 M.flei, 1 M.scrofulaceum, 1,2 M.fortuitum, 1 M.simae, 1,2 M.intracellularae, Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

20 Диагностика МБТ в различных материалах Материал Экссудаты (3+) БАЛ (3+) Поздние проросты ЛЙ (1+ / 2+) Всего Положительные 2259 Отриц Общее Чувствительность Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

21 Экспресс-идентификация культур МБТ: микроиммунохроматография vs PNB/NaS/ПЦР Чув. Аналит. Чувствит. Специф. Культура МБТ10*7 м.т.98, МБТ + контаминант10*7 м.т Длит.15 мин Косы МБТ, ZNх400МБ - ?, ZNх1000, жидкая питательная среда Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

22 Рекомендации по дифференциации видов МБТ/НТМБ мокрота Культура МБ «На глаз» /ПЦР/ культуральный тест Алгоритм определения комплекса видов МБТ МБТНТМБМБТ НТМБ Доступно Точно Быстро Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

23 Что это дает…? Снижение лабораторной нагрузки: Времязатраты на каждый тест снижается с 40 мин. лаб. времени до 3-5 мин. Сокращение длительности идентификации с 28 дней до 10 (!) мин. Реализация преимуществ ускоренных автоматизированных методов (Бактек-технологии) Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,

24 Спасибо за внимание! Попов Сергей Александрович Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва,