ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ – перераспределение материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых. - презентация

1 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

2 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ – перераспределение материала между молекулами или внутри молекулы ДНК, приводящее к появлению новых комбинаций генов или других нуклеотидных последовательностей. Отдельное место занимает рекомбинация на уровне РНК у некоторых РНК-содержащих вирусов (пикорнавирусы, коронавирусы). Р между молекулами ДНК представляет широкий набор различных по генетическому контролю и молекулярным механизмам. В отличие от других генетических процессов (репликация, репарация и др.), для рекомбинации необходим физический контакт между рекомбинирующими участками ДНК – СИНАПСИС. Исходя из молекулярных механизмов, генетического контроля и природы синапсиса, все известные рекомбинационные процессы можно подразделить на следующие типы:

3 ГОМОЛОГИЧНАЯ или ОБЩАЯ Р, или КРОССИНГОВЕР Здесь синапсис основан на спаривании цепей ДНК с комплементарными основаниями, для чего необходимо наличие протяженной гомологии между рекомбинирующими последовательностями. Чтобы обнажить комплементарные одноцепочечные (однонитевые) участки для синапсиса, необходимы разрывы и определенная деградация цепей ДНК. Процессы гомологичной Р осуществляют большие группы специальных белков. Из общей Р следует выделить ЭКТОПИЧЕСКУЮ Р. По существу, она является неаллельной. Эктопическая Р заключается кроссинговерах между отдельными повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что приводит к различным хромосомным перестройкам. По генетическому контролю, молекулярному механизму и природе синапсиса эктопическая Р относится к гомологичной.

4 Остальные типы рекомбинации не нуждаются в гомологии. Природа синапсиса у них принципиально иная: специальные белки узнают определенные последовательности ДНК и связываются с ними; образовавшийся ДНК-белковый комплекс входит в контакт (синпсис) с негомологичным дуплексом ДНК и осуществляет между ними обмены цепями. Типы негомологичной рекомбинации: САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ происходит между определенными нуклеотидами, находящимися в специальных рекомбинационных сайтах. Широко распространена у вирусов и бактерий, единственный известный случай у эукариот – 2µ- плазмида у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ключевыми ферментами сайт-специфической рекомбинации всегда являются сайт-специфические тороизомеразы типа I. Поэтому рекомбинация является консервативной, то есть осуществляется без каких-либо фиксированных повреждений или деградации ДНК и не нуждается в источниках энергии типа АТР.

5 ТРАНСПОЗИЦИИ – обширная группа рекомбинационных процессов, осуществляющих перемещения особых МОБИЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ из одного участка генома в другой. НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ. К ней относят рекомбинационные процессы между негомологичными ДНК, осуществляющиеся помимо сайт-специфической рекомбинации и транспозиций. У бактерий известен механизм обмена между негомологичными ДНК с использованием ДНК-гиразы, у эукариот основным является процесс соединения концов негомологичных дуплексов ДНК – non-homologous DNA end-joining (NHEJ).

6 ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

7 Гомологичная рекомбинация начинается с возникновения в одном или обоих дуплексах участков из одиночных цепей ДНК.Гомологичная рекомбинация начинается с возникновения в одном или обоих дуплексах участков из одиночных цепей ДНК. Затем эти участки с помощью специальных белков находят комплементарные последовательности в гомологичном дуплексе и образуют с ними гетеродуплекс – ключевой промежуточный продукт рекомбинации.Затем эти участки с помощью специальных белков находят комплементарные последовательности в гомологичном дуплексе и образуют с ними гетеродуплекс – ключевой промежуточный продукт рекомбинации. Конечным результатом рекомбинации является обмен равными частями гомологичных молекул.Конечным результатом рекомбинации является обмен равными частями гомологичных молекул.

8 Клетка-реципиент имеет кольцевую хромосому и получает от донора линейный фрагмент двуцепочечной ДНК. Большая часть донорного фрагмента замещает гомологичный участок в хромосоме. Кроссинговер происходит дважды. При конъюгации у E.coli

9 Эктопическая рекомбинация Эктопическая рекомбинация – частный случай гомологичной рекомбинации.Эктопическая рекомбинация – частный случай гомологичной рекомбинации. Она осуществляется между повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что может приводить к разнообразным хромосомным перестройкам.Она осуществляется между повторяющимися гомологичными последовательностями ДНК, тандемными или диспергированными по геному, что может приводить к разнообразным хромосомным перестройкам.

10 Тип возникающей перестройки зависит от ориентации повторяющихся последовательностей ДНК (прямая или обратная) и от их локализации (в одной хромосоме, в сестринских хроматидах, в гомологичных или в разных хромосомах). Рассмотрим два примера эктопической рекомбинации в случае прямых повторов ДНК.

11 Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации Молекула ДНК содержит повторяющиеся последовательности в прямой ориентации (два прямых повтора), обозначенные как bcd и bcd abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f +

12 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f + Для вхождения прямых повторов в синапсис дуплекс должен образовать петлю. Кроссинговер произошел на участке между b и с. Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Точки разрыва

13 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f + Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 1 линейный дуплекс с делецией участка, содержащего одну копию повтора b'cd, а также расположенную между повторами последовательность

14 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f + Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 1 линейный дуплекс с делецией участка, содержащего одну копию повтора b'cd и всю расположенную между повторами последовательность

15 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f + Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 2 кольцевой дуплекс, состоящий из делетированного материала

16 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации abcde b c d f abcd e b c d f ab c d e b c d f + Схема образования делеций в результате внутримолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 2 кольцевой дуплекс, состоящий из делетированного материала

17 Образование делеций и дупликаций в результате эктопической рекомбинации Схема образования дупликаций и делеций в хромосомах при межмолекулярной рекомбинации Гомологичные хромосомы (или хроматиды) содержат прямые повторы bcd и bcd

18 Схема образования дупликаций и делеций в хромосомах при межмолекулярной рекомбинации Рекомбинация может осуществляться между прямыми повторами, расположенными в разных участках гомологичных хромосом.

19 Схема образования дупликаций и делеций в хромосомах при межмолекулярной рекомбинации Кроссинговер произошел на участке между b и c

20 Схема образования дупликаций и делеций в хромосомах при межмолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 1 дуплекс, получивший дополнительную копию повтора bcd и расположенную между повторами последовательность e

21 Схема образования дупликаций и делеций в хромосомах при межмолекулярной рекомбинации Продукты рекомбинации: 2 дуплекс, утративший последовательность cdeb, вошедшую в первый дуплекс

22

23 Молекулярные механизмы гомологичной рекомбинации Модель Холлидея, 1964 г.

24 Модель Холлидея была разработана автором для объяснения явления генной конверсии а также некоторых закономерностей, связывающие ее с кроссинговером. Холлидей развивал свою модель в то время, когда изучение молекулярных механизмов кроссинговера только начиналось. Конверсия представляет собой нереципрокную гомологичную рекомбинацию, приводящую к нарушению менделевского расщепления аллелей 2:2 среди продуктов мейоза. Для выявления конверсии обычно используют метод тетрадного анализа у грибов-аскомицетов или базидиомицетов. В тетрадном анализе конверсия проявляется в виде тетрад с необычным соотношением аллелей в аскоспорах 3А:1а или 1а:3А, реже 3А:5а или 3а:5А, еще реже 4А:0а или 0А:4а. Слово конверсия означает превращение одного аллеля в другой.

25 Холлидей правильно предположил, что в основе этого явления лежит репарация (коррекция) неспаренных нуклеотидов в рекомбинационном гетеродуплексе (ГД). ГД – участок дуплекса ДНК, состоящий из цепей от разных родительских молекул, является важнейшим интермедиатом рекомбинационного процесса. Если в ГД попадают разные аллели гена, то возникающее локальное неспаривание оснований узнается специальными репарационными ферментами и подвергается репарации, где одно из неспаренных оснований удаляется вместе с окружающими нуклеотидами, а возникшая брешь застраивается по матрице комплементарной нити. Впоследствии такая репарация была продемонстрирована у E.coli и у эукариот под названием Mismatch Repair (MMR) – репарация неспаренных оснований. Основное назначение MMR – исправление ошибок, допускаемых ДНК- полимеразами в процессе репликации ДНК. Тот же механизм используется и для коррекции неспаренных оснований в рекомбинационных ГД. Это приводит к нарушению реципрокности рекомбинации в участке кроссинговера.

26 Mlh1, Pms1, Msh2, Msh3, Msh6 Репаративный синтез ДНК (ДНК-полимераза ) Упрощенная схема репарации неспаренных оснований ДНК (missmatch repair - MMR)

27

28 Генетические данные, полученные Фогелем, Мортимером и другими исследователями на дрожжах и других аскомицетах, свидетельствовали, что в мейотической рекомбинации конверсия может сопровождаться кроссинговером по внешним (фланговым) маркерам, а может не сопровождаться, причем эти события обычно равновероятны. Эти факты также легли в основу модели Холлидея. Отметим, при рекомбинации в соматических клетках конверсия, как правило, более чем в 90% случаев не сопровождается кроссинговером («конверсия без кроссинговера»). Этот факт объясняется опасностью возможных эктопических кроссинговеров, приводящих к хромосомным перестройкам. В то же время конверсия необходима для осуществления многих важных онтогенетических процессов. Но возвратимся к модели Холлидея.

29 Модель Холлидея основана на нескольких допущениях. 1. В двух гомологичных дуплексах ДНК, у эукариот соответствующих хроматидам, возникают первичные разрывы. 2. Разрывы вводятся в нити одинаковой полярности. 3. Первичные разрывы возникают в специфических сайтах, которые Холлидей называл рекомбинаторами. Гипотеза о существовании особых последовательностей ДНК («горячих точек» рекомбинации), в которых инициируется кроссинговер, разделялась многими генетиками, а к настоящему времени получила многочисленные экспериментальные подтверждения. 4. Затем от мест первичных разрывов происходит обмен цепями ДНК, приводящий к образованию структуры, получившей впоследствии название структуры Холлидея (Holliday junction или Holliday structure). 5. Затем должно произойти разрешение полухиазмы с помощью вторичных разрывов ДНК. Холлидей постулировал два типа вторичных разрывов. Разрывы 1-го типа возникают в обмениваемых нитях, в точке их перекрёста и приводят к образованию некроссоверных структур с внутренним ГД. Разрывы 2-го типа вводятся в 2 другие нити ДНК напротив точки перекрёста, что сопровождается формированием кроссоверных, также содержащих ГД в участке переброски цепей ДНК. Поскольку вторичные разрывы обоих типов, по Холлидею, равновероятны, а коррекция ГД есть конверсия, то одинакова и вероятность событий конверсии с кроссинговером и без него, что стремился объяснить Холлидей.

30 Модель Холлидея (Holliday, 1964)

31 Позднее, уже другими исследователями, модель Холлидея была дополнена двумя явлениями. 1. Миграция ветвления (branch migration) или миграция структуры Холлидея, в ходе которой точка перекреста нитей должна сместиться. Миграция структуры Холлидея должна сопровождаться вращением обоих дуплексов ДНК. Этот процесс необходим для формирования и удлинения ГД. 2. Изомеризация структуры Холлидея. Она в изменении структуры полухиазмы за счёт поворотов двух дуплексных сегментов («плеч») вокруг точки перекрёста на 180º (два других «плеча» не сдвигаются) за счёт теплового движения молекул. Структуры В и В на рисунке идентичны. Структура В представляет изображение В в крестообразном виде, что несколько приближает её к виду реальной полухиазмы. Такая структура подвергается разрешению путем введения вторичных разрывов, представляющих собой координированные разрывы двух цепей одинаковой полярности.

32 Электронно-микроскопическая фотография структур Холлидея

33 Важным достоинством модели Холлидея в является то обстоятельство, что с ней хорошо согласуются как генетические данные, так и результаты молекулярно-биологических исследований механизмов рекомбинации. Как уже отмечалось, крестообразные структуры Холлидея наблюдаются на электронно- микроскопических фотографиях ДНК из клеток разных организмов. Главное, что и у про- и у эукариотических организмов идентифицированы белки, осуществляющие все этапы, составляющие модель Холлидея. Известны эндонуклеазы, катализирующие первичные разрывы цепей ДНК, например, эндонуклеаза Spo11, иницирующая мейотическую рекомбинацию у дрожжей. Обмен цепями между гомологичными молекулами ДНК проводи белок RecA E.coli и его эукариотические гомологи. Реакцию миграции структуры Холлидея проводят специальные ДНК- хеликазы или хеликазо-подобные белки RuvA-RuvB или RecG у E.coli и Rad54, Rdh54, BLM и др. у эукариот. Эндонуклеаза, осуществляющая вторичные разрывы (резолваза) была впервые описана у фага T4 (продукт гена 49), затем у фага T7, дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а позднее и в клетках человека (культура клеток HeLa).

34 В последующие десятилетия модель Холлидея получила дальнейшие развитие. Представленные в ней процессы легли в основу современных молекулярных моделей гомологичной рекомбинации, прежде всего, схем путей рекомбинационной репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Далее мы охарактеризуем основные рекомбинационные белки а также их вспомогательные белки.

35 RecA – ГЛАВНЫЙ БЕЛОК гомологичной рекомбинации у E.coli. Мономер белка имеет размер около 37,8 kDa. В таком виде он неактивен. Для активации необходимы АТФ и ОН ДНК, представленная в любом виде: хвост, брешь, фрагмент или даже олигодезоксинуклеотид. В условиях in vitro мономеры белка RecA в присутствии АТФ кооперативно связываются с ОН ДНК и формируют вокруг нее правозакрученную белковую спираль (не путать с правозакрученной спиралью ДНК). Эта вытянутая по длине структура получила название «RecA-ДНК- филамент» или «пресинаптическая структура». В первых этапах формирования филамента участвует белок SSB, который распрямляет цепь ДНК и позволяет белку RecA строить филамент, но затем SSB вытесняется белком RecA. В условиях in vivo в сборке филамента участвуют и другие дополнительные белки. Сборка филамента происходит в направлении 5-3 относительно цепи ДНК, вокруг которой он строится. В филаменте RecA связан с ДНК в стойхиометрическом соотношении 1 мономер белка на 3 н. и 6,2 мономера на виток. Цепь ДНК располагается вдоль внутренней оси филамента. Если ОН ДНК находится в составе двунитевой (ДН) ДНК (ОН хвост или брешь), то формирующийся на ней филамент может перейти на дуплекс. Внутри филамента ДН ДНК вытянута в 1,5 раза по сравнению с В-формой ДНК.

36 Формирование RecA-ДНК-филамента и инициация рекомбинации

37 RecA-филамент (вид сбоку). По (по P.R. Bianco and S.C. Kowalczykowski, Encyclopedia of life sciences, 2001, с изменениями). ДНК невидна. Показаны мономеры RecA в филаменте. Одна сторона мономера относительно гладкая, на другой отчетливо выступают 3 доли. В филаменте хорошо различим большой спиральный желоб. Соответственно конформации мономера RecA, одна сторона жолоба гладкая, другая, с выступающими долями, шероховатая. Желоб является сайтом связывания с LexA и другими эффекторными белками и с ДН ДНК.

38 RecA-ДНК-филамент представляет АКТИВИРОВАННУЮ форму белка RecA. Активную форму белка RecA в составе RecA-ДНК-филамента принято обозначать как RecA *. Белок RecA E.coli полифункционален. Его активированная форма – RecA * играет ключевую роль в осуществлении трех совершенно различных процессов: 1. РЕКОМБИНАЦИЯ (синапсис и обмен цепями ДНК) происходит внутри филамента. Для рекомбинации необходимо, чтобы одна ДНК уже была в составе филамента, а другая должна быть «голой».

39 Функции белка RecA *

40 2. МУТАГЕННАЯ SOS-РЕПАРАЦИЯ. Здесь имеет место следующая последовательность событий: Нерепарированное к моменту репликации повреждение ДНК приводит к задержке машины репликации перед повреждением, то есть к появлению участка ОН ДНК и, соответственно, формированию на ней RecA-ДНК-филамента – RecA *. RecA * проявляет свойство копротеазы, которая стимулирует белок- репрессор LexA к аутопротеолитическому расщеплению молекулы LexA на две части. Под контролем LexA находятся около 30 генов, контролирующих так называемые SOS-функции, в том числе гены, кодирующие белки UmuC и UmuD. В результате инактивации репрессора LexA происходит индукция синтеза Umu-белков. При этом нативный белок UmuD под воздействием RecA * подвергается автопротеолитическому UmuD отщеплению от него небольшого N- концевого фрагмента, что превращает его в активную форму UmuD.

41 SOS-репарация О SOS-индукция О О - Некомплементарный нуклеотид ДНК-полимераза V (2UmuD-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) ДНК-пол.III TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG Ошибки UmuC UmuD RecA-ATP

42 Белки Umu образуют комплекс Umu(D) 2 C, ролучивший название ДНК-полимераза V (Pol V). Pol V оказывается в районе повреждения ДНК, где был сформирован RecA-ДНК-филамент, и перед которыми «застряла» ДНК-полимераза III. Затем к свободной Pol V происходит перенос первого мономера RecA от 3-конца филамента вместе с молекулой АТФ. В результате формируется активная форма Pol V – Pol V Mut или мутасома, которая способна пройти через повреждение, вставляя напротив него произвольные нуклеотиды. Такой процесс обхода повреждения ДНК в вилке репликация называют translesion DNA synthesis – TLS. После этого комплекс ДНК-полимеразы V диссоциирует от ДНК, а ДНК-полимераза III, продолжает нормальную репликацию ДНК. Приведенные данные объясняют, почему мутант recA неспособен к УФ- индуцированному мутагенезу.

43 SOS-репарация О SOS-индукция О О - Некомплементарный нуклеотид ДНК-полимераза V (2UmuD-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) ДНК-пол.III TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG Ошибки UmuC UmuD RecA-ATP

44 3. КОПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ RecA-ДНК-филамента (RecA * ) проявляется и в отношении репрессоров фага и других лямбдоидных фагов, которые под его действем также саморасщепляются на две части. Инактивация фаговых репрессоров приводит к индукции профагов. Поэтому мутант recA не способен осуществлять эти процессы. Копротеолитическая функция является уникальным свойством белка RecA E.coli. В то же время в отношении рекомбинационных активностей (синапсис и обмен цепями ДНК) он является прототипическим белком. Гомологи белка RecA обнаружены у всех изученных бактерий и низших и высших эукариот. Если геномы прокариот содержат по уникальной копии гена recA, то у эукариот встречается по несколько гомологов гена, один из которых обычно контролирует основную функцию, а другие – вспомогательные. У всех организмов рекомбинация, осуществляемая белком RecA или его гомологами, обязательно включает стадию формирования пресинаптического RecA-ДНК-филамента – RecA *.

45 Миграция ветви осуществляется белками RuvA и RuvB Белок RuvA связывает точку кроссинговера и затем фланкируется двумя гексамерными кольцами белка RuvB (с АТФазной активностью). Эти кольца лежат в противоположной ориентации и служат моторами, которые перемещают ДНК.

46

47 Сайт разрыва Димер RuvC Рекомбинантная цепь Интактная цепь Реакция разрешения полухиазмы, катализируемая эндонуклеазой RuvC E.coli

48 Генетический контроль рекомбинации у E.coli Пионером в изучении генетического контроля гомологичной рекомбинации у E.coli стал А.Кларк (A.Clark). В лаборатории Кларка была получена серия мутантов, дефектных по рекомбинации (rec), которые были охарактеризованы с помощью генетических, биохимических и электронно-микроскопического методов.

49 Первым в 1965 г. был выделен мутант по гену recA. Мутант имел следующий фенотип: 1. ПОЛНОЕ подавление рекомбинации при конъюгации и трансдукции. 2. Высокая чувствительность к УФЛ и другим ДНК- повреждающим агентам. 3. Высокий уровень деградации ДНК, как спонтанной, так и индуцированной. 4. Отсутствие УФ-индуцированного мутагенеза, то есть SOS- репарации. 5. Неспособность к индукции профага. Эти свойства соответствовали фенотипу мутанта с полной инактивацией гена, то есть null-recA. Впоследствии было выделено много других мутантов recA, но они имели уже иные характеристики. Плейотропность мутации recA указывала на участие несущего ее гена в разных генетических процессах. В конце 1970-х г.г. был разработан метод выделения и очистки продукта гена recA – белка RecA и началось его активное изучение.

50 В 1967 г. были получены мутанты по генам recB и recC. Эти гены кодируют субъединицы одного фермента, поэтому оба мутанта имеют одинаковый фенотип: 1.Подавление рекомбинации при конъюгации и трансдукции, но, в отличие от мутанта recA, неполное, варьирующее от долей процента до нескольких процентов, в типичном случае – до 1%. 2. Повышенная чувствительность к УФЛ и другим ДНК- повреждающим агентам, но не столь высокая, как у мутанта recA. 3. Пониженная жизнеспособность клеток мутантов: до 80% клеток в их культурах нежизнеспособны. Поскольку оба мутанта фенотипически неотличимы, обычно используют их двойные мутанты, которые обозначают как recBC.

51 Значительно позднее, в 1986 г. уже в другой лаборатории (G.Smith, A.Taylor и др.) был выделен мутант по гену recD. Этот мутант резко отличается от мутантов recB и recC. Он способен к рекомбинации, устойчив к УФЛ и другим ДНК-повреждающим агентам и имеет высокую выживаемость. Ген recD кодирует субъединицу RecD, которая вместе субъединицами RecB и RecC формирует белок RecBCD-энзим (или RecBCD-нуклеазу). Различие в фенотипах между мутантами объясняется различной функциональной ролью субъединиц белка RecBCD.

52 ОСНОВНЫЕ БЕЛКИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ГОМОЛОГИЧНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ Процесс гомологичной рекомбинации разделяют на 3 основные стадии: ПРЕСИНАПСИС – подготовка ДНК-субстрата к рекомбинации: введение разрывов, образование участка ОН ДНК, формирование на ОН ДНК RecA- ДНК-филамента. СИНАПСИС – нахождение гомологии и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК. ПОСТСИНАПСИС – миграция и разрешение структуры Холлидея. По этим стадиям принято распределять белки, осуществляющие рекомбинации.

53 Основные стадии рекомбинации, осуществляемой белком RecA ( по P.R. Bianco and S.C. Kowalczykowski, Encyclopedia of life sciences, 2001, с изменениями)

54 Следующим пресинаптическим белком, который готовит рекомбиногенный субстрат для белка RecA (3OH-концевая ОН ДНК) является RecBCD-нуклеаза E.coli. Этот белок играет ключевую роль не только в рекомбинации, но и в рекомбинационной репарации двунитевых разрывов (ДНР) ДНК. Особенно важна ее роль в репарации спонтанных ДНР, приводящих к разрушению вилок репликации ДНК. Последнее обстоятельство объясняет пониженную жизнеспособность клеток мутантов по генам recB и recC. Очищенный белок RecBCD является АТФ-зависимым. В реакциях in vitro проявляет по крайней мере 6 активностей: 1. ДНК-хеликаза; 2. ДН экзонуклеаза; 3. ОН экзонуклеаза; 4. ДНК-зависимая АТФаза; 5. слабая ОН эндонуклеаза; 6. способность нагружать белок RecA на ОН ДНК, то есть участие в формировании нуклеопротеинового филамента для рекомбинации и рекомбинационной репарации ДНР ДНК.

55 Применение комбинации генетических, физических и электронно-микроскопического методов к изучению RecBCD- нуклеазы позволило построить следующую картину: Субстратом для RecBCD-нуклеазы является дуплекс ДНК с тупыми или почти тупыми концами. Фермент атакует оба конца дуплекса, связывается с ними и начинает раскручивать дуплекс. Каждая из субъединиц RecB и RecD имеет АТФ-зависимую хеликазную активность. При раскручивании RecB движется вдоль 3-5-цепи, RecD – вдоль 5-3-цепи. RecB перемещается медленнее, чем RecD, поэтому впереди нее образуется ОН петля, которая растет по мере прохождения реакции. RecBCD способна раскрутить до 30 т.п.н.

56 Активность белка RecBCD регулируется сайтом Chi, который имеются только у E.coli и некоторых энтеробактерий. Chi-сайт являются горячей точкой рекомбинации. Сhi-сайт имеет последовательность 5-GCTGGTGG-3 и активен, только если фермент, раскручивая дуплекс, подойдет к нему с правой (3) cтороны. Когда фермент встречает правильно ориентированный сайт, его активность меняется: он никирует 3-цепь за несколько нуклеотидов до Chi. Дальнейшее раскручивание дуплекса выталкивает рекомбиногенный ОН фрагмент с Chi на 3-конце (S.K.Amundsen & G.R.Smith, 2007). Chi-сайт также стимулирует RecDCD нагружать RecA на ОН хвост с Chi на конце. Таким образом, нуклеаза RecBCD является пресинаптическим белком, готовящим ДНК-субстрат для белка RecA.

57

58 Nick-at-Chi модель рекомбинации, осуществляемой RecBCD-нуклеазой у E. coli (S.K.Amundsen & G.R.Smith, 2007) RecBCD связывается с концом ДН ДНК (А) и раскручивает ее, одновременно формируя петлю ОН ДНК (В). ОН ДНК позади RecBCD ренатурируют, что формирует структуру в виде «заячьих ушей» (С). Перед Chi-сайтом (маленький серый кружок) RecBCD никирует верхнюю (3) цепь (D) и продолжает раскручивать дуплекс, в результате чего образуется ОН 3-хвост с Chi на конце. RecBCD загружает на 3-ОН ДНК белок RecA (Е), после чего RecBCD покидает ДНК и диссоциирует на 3 субъединицы. Возникший RecA-ДНК-филамент вступает в рекомбининацию с гомологичным дуплексом ДНК с формированием D-петли (F).

59 ПОСТСИНАПСИС – МИГРАЦИЯ ПОЛУХИАЗМЫ ХОЛЛИДЕЯ

60

61

62 ГенБелокАктивности Инициаторы (пресинапсис) recB RecBCD АТФаза, ДНК-хеликаза, ДН ДНК экзонуклеаза, ОН ДНК экзонуклеаза, Chi-специфическая эндонуклеаза. Формирует рекомбиногенный 3-хвост и участвует в формировании RecA-ДНК-филамента recC recD recE ExoVIII 5-3 ДН ДНК экзонуклеаза (изозим экзонуклезы ) recJ RecJ 5-3 ОН ДНК экзонуклеаза recQ RecQ ДНК-хеликаза xseA ExoVII 5- ОН ДНК экзонуклеаза ssb SSB Белок, связывающийся с ОН ДНК и стабилизирующий ее Гены и белки гомологичной рекомбинации у E.coli

63 ГенБелокАктивности Гомологичное спаривание и strand exchange (синапсис) recARecA Формирует RecA-ДНК-филамент, который катализирует гомоголичное спаривание и strand exchange и является копротеазой белков LexA, репрессора, UmuD и др. recFRecF Белок, связывающийся с ОН ДНК; может функционировать в комплексе с RecO и RecR и участвовать в формировании RecA-ДНК- филамента recO recR RecO RecR Совместно cтимулируют связывание белка RecA с ОН ДНК (участвуют в формировании RecA-ДНК- филамента) ssbSSB

64 ГенБелокАктивности Миграция и разрешение полухиазмы (постсинапсис) ruvARuvA Специфическое связывание с точкой перекреста в структуре Холлидея, нацеливает RuvB на ДНК ruvBRuvB АТФаза, ДНК-хеликаза, осуществляет миграцию полухиазмы (вместе с RuvA) ruvCRuvC Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея recGRecG АТФаза, ДНК-хеликаза, специфически связывающаяся с точкой перекреста в структуре Холлидея, осуществляет миграцию полухиазмы rusARusA Специфическая эндонуклеаза, разрешающая структуры Холлидея

65 Биологическое значение гомологичной рекомбинации Лежит в основе репарации двуцепочечных разрывов хромосом - самого тяжелого типа повреждений ДНК, вызываемых ионизирующими излучениями или возникающих спонтанно.Лежит в основе репарации двуцепочечных разрывов хромосом - самого тяжелого типа повреждений ДНК, вызываемых ионизирующими излучениями или возникающих спонтанно. Вносит вклад в генетическую изменчивость, лежащую в основе эволюции. Вносит вклад в генетическую изменчивость, лежащую в основе эволюции. Необходима для правильного расхождения хромосом в мейозе и для самого мейоза. Необходима для правильного расхождения хромосом в мейозе и для самого мейоза. Участвует в поддержании генетической стабильности повторяющихся генов.Участвует в поддержании генетической стабильности повторяющихся генов.

66 Биологическое значение гомологичной рекомбинации Эктопическая рекомбинация Вносит существенный вклад в возникновение перестроек хромосом. Является одним из основных источников дупликаций генов и других последовательностей ДНК – это один из процессов, лежащий в основе эволюции генетического материала.Вносит существенный вклад в возникновение перестроек хромосом. Является одним из основных источников дупликаций генов и других последовательностей ДНК – это один из процессов, лежащий в основе эволюции генетического материала. Участвует в регуляции экспрессии генов путем онтогенетических перестроек генетического материала.Участвует в регуляции экспрессии генов путем онтогенетических перестроек генетического материала.

67 РЕКОМБИНАЦИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ ДВУНИТЕВЫХ РАЗРЫВОВ (ДНР) ДНК

68 ДВУНИТЕВЫЕ РАЗРЫВЫ (ДНР) ДНК относятся к наиболее тяжелым и сложно репарируемым повреждениям ДНК. Наиболее эффективно ДНР ДНК индуцируют ионизирующие излучения. Выход разрывов в результате облучения составляет (0,5-1)х ДНР/Da/Gy для прокариотических клеток и около 2х ДНР/Da/Gy для эукариот. В зависимости от вида и условий облучения на 1 ДНР возникает от 7 до 60 однонитевых разрывов (ОНР) ДНК. Но именно ДНР вносят основной вклад в гибель клеток, перестройки хромосом и генетическую нестабильность. В клетках, в которых репарация ДНР не осуществляется, например, в гаплоидных G1-клетках дрожжей или в клетках, дефектных по репарации разрывов клетках бактерий, 1 ДНР является летальным событием. В диплоидных клетках дрожжей 1 нерепарированный разрыв обычно приводит к утрате несущей его хромосомы.

69 Хотя процессы возникновения и репарации ДНР ДНК, индуцированных ионизирующими излучениями, представляют большой теоретический и практический интерес, их биологическое значение невелико по сравнению с ролью тех же процессов, необходимых для функционирования клеток в нормальных условиях. ДНР регулярно возникают и в нормальных условиях в ходе ряда рекомбинационных процессов (инициация мейотической и, возможно, митотической рекомбинации, переключение локусов типа спаривания у гомоталличных дрожжей, перестройки в иммуноглобулиновых последовательностях ДНК при формировании генов, кодирующих антитела (иммуноглобулины) и рецепторы Т-лимфоцитов), а также в процессе репликации ДНК, когда аппарат репликации встречает в разрыв в одной из цепей ДНК в вилке репликации, что приводит к разрыву (коллапсу) всей вилки.

70

71 В клетках эукариот любая рекомбинация, кроме транспозиций, инициируется ДНР ДНК. Репарация ДНР осуществляется по рекомбинационному механизму, и поэтому называется рекомбинационной репарацией. И наоборот, эукариотическая рекомбинация по существу сводится к репарации ДНР ДНК.

72 У бактерий и низших эукариот репарация ДНР ДНК осуществляется почти полностью на основе гомологичной рекомбинации. У высших эукариот гомологичная рекомбинация является единственным механизмом, работающим в мейотических клетках. Однако, в соматических клетках доминирующим путем репарации ДНР ДНК является негомологичная рекомбинация – NHEJ. Гомологичная рекомбинация в соматических клетках происходит, в основном, на стадии репликации ДНК с участием сестринских хроматид, часто в поврежденных вилках репликации. Сначала рассмотрим пути репарации ДНР ДНК, основанные на гомологичной рекомбинации. Отметим, что эти пути включают стадию формирования структур Холлидея.

73 При рекомбинационной репарации ДНР ДНК происходит внедрение 3- концов ДНК в гомологичный дуплекс с образованием D-петель. Также такие структуры называют joint-молекулами. Структура D-петли обеспечивает праймер (3-конец внедрившейся цепи ДНК) для репаративной репликации ДНК, которая необходима для восстановления генетической информации, утраченной в сайте ДНР, и для последующего восстановления непрерывной структуры ДНК. Одновременно этот процесс обеспечивает и генную конверсию. Далее joint-молекулы вступают в 2 основных пути рекомбинационной репарации: double-strand break repair (DSBR) и synthesis-dependent strand annealing (SDSA). Путь DSBR включает формирование двойных структур Холлидея, которые далее разрешаются специфическими резолвазами с образованием продуктов с конверсией с кроссинговером и без кроссинговера. В пути SDSA после осуществления репаративной репликации ДНК происходит диссоциация joint-молекулы (D-петли), после чего следует воссоединение разорванных концов путем отжига (annealing) комплементарных цепей ДНК.

74 Модель рекомбинации репарации на основе репарации ДНР ДНК (double-strand break repair, DSBR) – путь с конверсией и с кроссинговером по фланговым маркерам (Szostak, Orr-Weaver, Rothstein and Stahl, 1983)

75

76 Как видно из схемы на предыдущем слайде, рекомбинационная репарация ДНР ДНК по пути DSBR приводит, как это было в схеме Холлидея, к равновероятному формированию рекомбинантных продуктов с конверсией, сопровождающейся и не сопровождающейся кроссинговером по фланговым маркерам. Поэтому неудивительно, что путь DSBR функционирует преимущественно в мейотических клетках, где формирование продуктов кроссинговера в виде хиазм необходимо для правильного распределения гомологичных хромосом в первом делении мейоза, а также для повышения генетического разнообразия гамет. Репарация ДНР ДНК, осуществляемая с помощью негомологичной/незаконной рекомбинации, будет рассмотрена в конце этой презентации.

77 НЕГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ Далее мы рассмотрим системы рекомбинации, обходящиеся без гомологии между рекомбинирующими ДНК. Хотя эти системы внесли существенный вклад в эволюцию генетического материала, наиболее ярко их биологическое значение проявляется в онтогенетических перестройках геномов, играющих важную роль в жизнедеятельности вирусов, бактерий и эукариот. Эти системы - сайт-специфическая рекомбинация, транспозиция и незаконная рекомбинация - в корне отличаются от гомологичной рекомбинации по механизмам и генетическому контролю.

78 CАЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

79 Сайт-специфическая происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах коротких участков гомологии, обычно п.н. При этом гомологичные последовательности для самой рекомбинации не нужны, они необходимы для их узнавания рекомбинационными белками. Сайт-специфическая рекомбинация широко распространена у бактерий и бактериофагов. Наиболее известные примеры сайт-специфической рекомбинации: интеграция фага лямбда и ряда других умеренных фагов в бактериальные хромосомы; обширная группа сайт-специфических инверсий у бактерий и фагов. Ключевыми белками сайт-специфической рекомбинации всегда являются топоизомеразы типа I.

80 Эти ферменты отличаются от обычных топоизомераз сайт- специфичностью, то есть они связываются с определёнными последовательностями в ДНК и затем самостоятельно или с помощью других белков строят на ней сложные топологические структуры, необходимые для последующего обмена цепями. Процессы сайт-специфической принципиально отличаются от того, что происходит в случае гомологичной рекомбинации. При гомологичной рекомбинации эндонуклезы делают фиксированные разрывы фосфодифирных связей в цепях ДНК, и для восстановления этих связей необходимы ДНК-лигаза и источник энергии (например, АТФ). Наоборот, реакции сайт-специфической рекомбинации являются консервативными в энергетическом отношении. Как известно, любая топоизомераза производит нефиксированные, временные (transient) разрывы цепей ДНК, при этом она образует ковалентную (фосфодиэфирную) связь с фосфатным остатком в точке разрыва, благодаря чему энергия исходной фосфодиэфирной связи консервируется. Последующее замыкание концов в разрыве осуществляется без затрат внешней энергии.

81 Еще одной характерной особенностью сайт-специфической рекомбинации является упорядоченность и, за отдельными исключениями, высокая точность ее реакций. Эти свойства обеспечиваются специфичностью сайт-специфических рекомбиназ и особой организацией ДНК-белковых комплексов, осуществляющих рекомбинацию.

82 Последствия сайт-специфической рекомбинации

83 После проникновения в клетку линейная ДНК фага замыкается в кольцо за счет имеющихся не ее концах комплементарных одноцепочечных последовательностей и превращается в ковалентно- замкнутую кольцевую молекулу

84 Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда attB attB (attachment site on the bacterial chromosome) attP attP ( attachment site on the bacteriophage) 22 п.н. 255 п.н.

85 Профаг Схема сайт-специфической рекомбинации у фага лямбда Int и Xis – фаговые белки IHF и FIS – бактериальные белки 15 п.н. 22 п.н. 255 п.н.

86 Рассмотрим основные принципы функционирования интегразных систем на примере интеграции и эксцизии бактериофага λ в хромосому E.coli. После инфекции клетки E. coli линейная вирионная ДНК фага замыкается в кольцо за счет комплементарных одноцепочечных концов. Если последующее развитие фага идет не по литическому пути, он интегрирует в хромосому бактерии между генами gal и bio. Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att (attachment)-сайтами: attP в хромосоме фага и attB – бактерии. Интегрированный фаг называется профагом. Он фланкирован рекомбинантными сайтами attL (левый) и attR (правый). Вырезание (эксцизия) профага из хромосомы при индукции происходит в обратной последовательности. Запись реакций в обобщенном виде представлена на рис. Из нее следует, что в интегративной рекомбинации участвуют сайты attP и attB, продукт фагового гена int – Int (интеграза) и белок IHF (integration host factor) E. coli. Для эксцизии необходимы сайты attL и attR, те же белки, а также еще бактериальный белок Fis и фаговый белок Хis, который распознает только эти att-сайты (но не attP и attB) и экспрессируется только у профага.

87 Схема интеграции фага λ в хромосому Е.coli и эксцизии из хромосомы

88 Сайты attP и attB неравноценны. Первый устроен сложно. При размере около 270 п.н. он состоит из центральной (коровой) части О из 15 п.н. (из которых 12 – А-Т-пары) и двух фланкирующих частей P и P'. Внутри сайта attP располагаются 7 участков связывания с интегразой Int, а также участки связывания с белками IHF и Xis. Сайт attB устроен проще. Его размер всего 23 п.н., гомология с attP ограничена коровой частью из 15 п.н., в которой имеются 2 сайта связывания с интегразой. Интеграза Int имеет 2 активности, обеспечивающие узнавание и связывание с ДНК в att-сайтах и топоизомеразную. В результате связывания attP с интегразой и белком IHF формируется сложно уложенная нуклеопротеидная структура, которая захватывает сайт attB и образует синаптический интермедиат (интасома), где рекомбинирующие последовательности att-сайтов удерживаются за счет взаимодействий между белками. Топоизомеразная активность Int используется в процессах обмена цепями между att-сайтами.

89

90 НЕЗАКОННАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ

91 Незаконная рекомбинация – сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК.Незаконная рекомбинация – сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК. По своим механизмам эта рекомбинация отличается от сайт-специфической рекомбинации и транспозиции.По своим механизмам эта рекомбинация отличается от сайт-специфической рекомбинации и транспозиции. Играет важную роль в хромосомных перестройках.Играет важную роль в хромосомных перестройках.

92 К НЕЗАКОННОЙ (ILLEGITIMATE) РЕКОМБИНАЦИИ относят рекомбинационные процессы, происходящие либо вообще без гомологии между рекомбинирующими участками ДНК, либо с минимальной гомологией (2-5 п.н.). При этом к незаконной рекомбинации не сайт-специфическую рекомбинацию и транспозиции, которые также осуществляются без гомологии, но выделены в отдельные типы рекомбинационных процессов. В настоящее время к незаконной рекомбинации относят неточную эксцизию профага, приводящую к образованию специфических трансдуцирующих фаговых частиц, интеграцию чужеродной ДНК в хромосомы клеток млекопитающих при их трансфекции, соединение концов негомологичных дуплексов ДНК и т.д. У эукариотических организмов широко распространен особый механизм незаконной рекомбинации, получивший в англоязычной литературе название non-homologous end joining (NHEJ) – соединение негомологичных концов ДНК. Основное назначение этого типа рекомбинации – репарация ДНР ДНК.

93 Основу NHEJ составляют два белковых комплекса: ПЕРВЫЙ комплекс включает белки Ku70 и Ku80, формирующие гетеродимер в виде полого внутри кольца. Ku-гетеродимер в свою очередь образует комплекс с каталитической субъединицей ДНК-протеинкиназы – DNA-PKcs. Этот комплекс называют ДНК-зависимой протеинкиназой – DNA-PK. Активность DNA-PK необходима для посадки Ku на ДНК, когда комплекс Ku-DNA-PKcs собирается на ее концах. Связывание Ku с концами ДНР стимулирует киназную активность DNA-PK. У млекопитающих в комплекс входит недавно (2002 год) обнаруженная нуклеаза Artemis (греческая богиня охоты Артемида), которая вскрывает шпилечные структуры на кодирующих концах ДНР, формируемых в ходе V(D)J-рекомбинации, и может удалять лишние нуклеотиды. Таким образом, роль комплекса заключается в узнавании и сближении концов ДНР. Считается также, что Ku и DNA-PKcs рекрутируют белки второго (лигазного) комплекса в NHEJ и стимулируют их к замыканию концов ДНК.

94 DNA-PK CS Гетеродимер Ku80/Ku70 Artemis Лигирование DNA-PK CS – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK); XRCC4 – X-ray-repair-cross- complementing defective repair in Chinese hamster mutant 4. Artemis – нуклеаза, разрезающая шпильки и осуществляющая процессинг концов ДНК Cernunnos/HLF участвует в сборке и стимулирует лигирование комплексом XRC4-лигазы IV Репарация ДНР ДНК путем non-homologous end joining (NHEJ) у млекопитающих Сближение концов ДНК ДНР DNA-PK ДНК-лигаза IV XRCC4 XFL/Cernunnos

95 ВТОРОЙ (лигазный) комплекс состоит из каталитической субъединицы ДНК-лигазы IV, ее кофактора XRCC4, участвующего в этапе лигирования, а также недавно (2006 год) открытого белка XLF (XRCC4-like factor), получившего второе название Cernunnos (Цернун) в честь божества из кельтской мифологии. Функция комплекса – ковалентное замыкание концов ДНК.

96 У млекопитающих NHEJ является основным путем репарации ДНР ДНК. Соотношение между негомологичными и гомологичными путями рекомбинации/репарации у высших эукариот зависит от нескольких факторов, прежде всего от вида организма, типа клеток и фазы клеточного цикла. В G1 и в ранней S-фазе соматических клеток доминирует NHEJ. В течение S и G2, когда сестринские хроматиды могут активно использоваться в качестве матриц, преобладает гомологичная рекомбинация, но NHEJ также может функционировать. ДНР, индуцируемые белками RAG1 и RAG2 (V(D)J-рекомбинация) в лимфоидных клетках, восстанавливаются исключительно путем NHEJ/ В гаметогенезе участвует исключительно гомологичная рекомбинация. В ранней мейотической профазе отсутствует белок Ku70, и репарация ДНР с участием неточной NHEJ невозможна.

97 Фенотипы мутантов мыши, дефектных по репарации двунитевых разрывов ДНК, осуществляемой по механизму NHEJ DNA-PKcs – каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы; XRCC4 – X-ray-repair-cross complementing defective repair in Chinese hamster mutant; XLF – XRCC4-like factor (Cernunnos); SCID – severe combined immunodeficiency. ГенФенотип мутантной клеткиФенотип мутантной мыши PRKDC, кодирует DNA- PKcs Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Радиочувствительность, SCID, опухоли T- клеток KU70 Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Радиочувствительность, SCID, опухоли T- клеток, задержка роста KU80 Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Радиочувствительность, SCID, опухоли T- клеток, задержка роста ArtemisПодавлена V(D)J-рекомбинацияSCID LIG4, кодирует ДНК- лигазу IV Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Эмбриональные летали, апоптоз постмитотических нейронов, лейкемия XRCC4 Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Эмбриональные летали, апоптоз постмитотических нейронов XLF/Cernunnos Радиочувствительность, подавлена V(D)J-рекомбинация Радиочувствительность,иммунодефицит, микроцефалия, задержка роста, задержка умственного развития, Т+В лимфоцитопения

98 Приведенные в таблице данные свидетельствуют об огромной биологической важности незаконной рекомбинации/NHEJ.

99 Рекомендуемая литература Дополнительная 1.Глазер В.М. Гомологичная генетическая рекомбинация. Современное естествознание. Энциклопедия. Т.8, Глазер В.М. Генетическая рекомбинация без гомологии: процессы, ведущие к перестройкам в геноме. Современное естествознание. Энциклопедия. Т.8,