3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра. - презентация

1 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра k cat /K M. Порядок величин. Методы их определения Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра k cat /K M. Порядок величин. Методы их определения

2 Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен v = E

3 Мауд Леонора Ментен 1879 – 1960, Канада биохимик и физиолог Леонор Михаэлис Берлин, Германия - Нью-Йорк, США биохимик и химик-органик

4 Интерпретация кинетических параметров для односубстратных реакций: механизм Михаэлиса-Ментен k cat V V

5 Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен 1) Механизм Бриггса-Холдейна (К M >K S )

6 Промежуточное соединение, образующееся вслед за образованием ES: К M

7 Порядок величин параметров k cat, K M, k cat /K M – Константа k cat [cек -1 ] характеризует число оборотов ферментативной реакции. Как правило, ферменты без кофакторов (например, трипсин, химотрипсин) работают с медленной скоростью, их k cat от 10 2 cек -1. Ферменты, использующие для катализа реакции кофакторы (например, оксидоредуктазы), работают с большей эффективностью, их k cat до 10 7 cек -1. – Константы скорости связывания (k 1 ) в ферментативной кинетике обычно порядка с -1. Сродство субстрата к ферменту определяется величиной константы диссоциации (Kd) комплекса фермента с субстратом. Kd=k -1 /k 1 [моль/л=М] Чем ниже величина Kd, тем выше сродство субстрата к ферменту, то есть прочнее фермент-субстратный комплекс. Величина Kd может варьировать от М (неэффективное связывание субстрата с ферментом, таким образом, низкое сродство субстрата к ферменту), до М (высоко эффективное связывание, практически такое же прочное, как ковалентное). – Для механизма Бриггса-Холдейна отношение k cat /K M равно ~ М -1 с -1.

8 Параметр k cat – число оборотов фермента, определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт одним активным центром в единицу времени -В том случае, когда имеется один фермент-субстратный комплекс и все стадии связывания достаточно быстрые, k cat – константа скорости первого порядка для превращения комплекса ES в комплекс ЕР. -В более сложных случаях k cat – функция всех констант скорости первого порядка. Например, для механизма, когда комплекс ЕР диссоциирует достаточно быстро, k cat =k 2 : -Для следующей схемы k cat является функцией констант k 2 и k 3 (k cat = k 2 k 3 /(k 2 +k 3 )): Однако, если одна из этих констант много меньше другой, k cat становится равной меньшей константе. Например, если k 3

9 K M =K S для простого механизма Михаэлиса-Ментен. В некоторых других случаях: K M = где [ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм. Для механизма действия химотрипсина: [ES΄] = [ES]k 2 /k 3 При k 2 >>k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в величину K M больший вклад, чем [ES], являясь преобладающей ферментсодержащей формой. K M меньше K S приблизительно в k 3 /k 2 раз: K MK S (k 3 /k 2 ) Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен Б) Величина K M

10 Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен В) Параметр k cat /K M Отношение k cat /K M не может превышать ни одну из констант скорости второго порядка для последовательности реакций, идущих в прямом направлении, и представляет собой нижний предел для константы скорости при связывании фермента с субстратом. Скорость реакции при низких концентрациях субстрата определяется уравнением v=(k cat /K M )[E] 0 [S], т.е. отношение k cat /K M представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Этот параметр не является истинной микроскопической константой, за исключением крайнего случая, когда реакция лимитируется столкновением фермента с субстратом. Параметр k cat /K M связывает скорость реакции с концентрацией свободного фермента, а не с его общей концентрацией. При низкой концентрации субстрата фермент находится преимущественно в свободном состоянии ([Е][Е] 0 ), и, следовательно, скорость реакции есть v=(k cat /K M )[E][S].

11 Графическое представление данных

12 1. График Лайнуивера-Берка

13 2. График Эдди-Хофсти v = V max - vK M /[S]

14 3. График зависимости V max от K M V max = v + K M v/[S]