10. Сайт-направленный мутагенез, применение для исследования механизма ферментативного катализа Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 10. - презентация

1 10. Сайт-направленный мутагенез, применение для исследования механизма ферментативного катализа Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 10. Сайт-направленный мутагенез, применение для исследования механизма ферментативного катализа

2 Химический мутагенез одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК – метод введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitro Принцип метода: Принцип метода: некоторые химические мутагены, такие как бисульфит натрия, гидроксиламин или метоксиламин, действуют только на одноцепочечные участки ДНК.Пример: Одноцепочечные участки ДНК Дезаминирование остатков цитозина С U Достройка цепи ДНК-полимеразой G-С-пары T-U-пары Трансформация ДНК с мутацией в бактериальные клетки Репликация Замена остатков U на T и полная замена G-С-пары на A-T (транзиция) NaHSO 3

3 Недостатки метода химического мутагенеза Ограничения на спектр возникающих мутаций, так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения, поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов. Проблему можно частично решить, используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов, например N-гидроксицитидинтрифосфат, который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G, или создавая такие условия, при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды. Ограничения на спектр возникающих мутаций, так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения, поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов. Проблему можно частично решить, используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов, например N-гидроксицитидинтрифосфат, который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G, или создавая такие условия, при которых ДНК-полимераза репарации начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды. Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки, подверженные мутации, представляют собой сложную смесь, в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций. Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора, сопряженную с анализом большого числа мутантов. Молекулы ДНК из одной реакционной пробирки, подверженные мутации, представляют собой сложную смесь, в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций. Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить сложную процедуру отбора, сопряженную с анализом большого числа мутантов.

4 Сайт-направленный (сайт-специфический) мутагенез Сайт-направленный мутагенез - совокупность методов получения мутаций в определенных сайтах, основанных на использовании генно- инженерных подходов. Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет путем мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК и, следовательно, направленной замены аминокислотного остатка, получать белки и ферменты с измененными свойствами. С помощью этого метода можно идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков. Для развития метода необходимо знать исходную последовательность генов белков, то есть должны быть развиты и применяемы методы генной инженерии. Кроме того, поскольку для нуклеотидной замены в заранее известном сайте ДНК синтезируют короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (праймеры), комплементарные целевой ДНК за исключением места, выбранного для мутации, метод сайт-направленного мутагенеза требует развития методов химического синтеза олигонуклеотидов. Метод сайт-направленного мутагенеза появился только в 70-х годах 20-го века, когда перечисленные методы стали активно развиваться.

5 Метод сайт-направленного мутагенеза в сочетании с рентгеноструктурным анализом (РСА) белков РСА исходного белка дикого типа Получение мутантного белка Изучение отличия полученного белка от исходного с помощью РСА, методов ферментативной кинетики и др. РСА мутантных ферментов для их комплексов с субстратами и ингибиторами

6 Майкл Смит Блэкпул, UK - Ванкувер, Канада Биохимик Нобелевская премия по химии 1993 г. Кэри Б. Муллис 1944 Леноир, США Биохимик Нобелевская премия по химии 1993 г. Метод сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров был впервые описан в 1978 году, а в 1993 году основоположник метода Майкл Смит (Michael Smith) был удостоен Нобелевской премии совместно с Кэрри Б. Муллис (Kary B. Mullis), независимо от него разработавшего метод ПЦР.

7 ПЦР для сайт-направленного мутагенеза Исходная ДНК и праймеры 1-ая ПЦР 2-ая ПЦР 3-я ПЦР ДНК-копия с мутацией Синтезируют пару праймеров, несущих мутацию, и пару праймеров, комплементарных концам нужного фрагмента ДНК. В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией, которые объединяют в третьей реакции. Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию. ПЦР позволяет проводить сайт- направленный мутагенез с использованием праймеров, несущих мутацию, а также случайный мутагенез. В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся ДНК-полимеразой в условиях, понижающих ее специфичность.

8 Ser Ala Замена в гене нужного фермента в плазмиде осуществляется путем замены в нужном кодоне комплементарного праймера: TСC (Ser)GCC (Ala). Далее полимераза без 3-5-экзонуклеазной активности удлиняет этот праймер и ДНК-лигаза восстанавливает целостность цепи. Модифицированный белок экпрессируется и подвергается необходимым процедурам анализа.

9 Аланиновое сканирование Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту – чаще всего, на аланин (Ala). Целенаправленная замена на нейтральную аминокислоту – чаще всего, на аланин (Ala). Введение остатка Ala в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации, как, например, при заменах на глицин или пролин, и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами. Введение остатка Ala в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации, как, например, при заменах на глицин или пролин, и не сопровождается электростатическими или стерическими эффектами. Аланин часто встречается как во внутренних, так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул. Аланин часто встречается как во внутренних, так и во внешних участках полипептидных цепей белковых глобул. С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты, образующие активный центр ферментов, влияющие на активность белка, а также исследовать участки полипептидных цепей, существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами, изучить структурные и функциональные особенности белков. С помощью сканирования аланином можно локализовать аминокислоты, образующие активный центр ферментов, влияющие на активность белка, а также исследовать участки полипептидных цепей, существенные для взаимодействия белков с другими макромолекулами и низкомолекулярными лигандами, изучить структурные и функциональные особенности белков.

10 Аминокислоты, остатки которых в составе белков заменяются на Ala при применении метода сайт-направленного мутагенеза, и причины, по которым они могут подвергаться замене

11 Исследована роль водородных связей в реакции активации аминокислоты и изменение при замене аминокислотных остатков кинетических характеристик реакции (К М и k cat ), катализируемой тирозил-тРНК-синтетазой из Bacilus Stearothermophilus. Водородная связь является направленной и поэтому играет большую роль в проявлении специфичности ферментов, а образование сетки водородных связей – хороший способ организации субстрата в активном центре. Сэр Алан Фершт 1943 Лондон - Кембридж, UK Биохимик

12 Тирозил-тРНК-синтетаза Функциональный димер (α2), катализирует аминоацилирование тРНК, промежуточным продуктом в цепи превращений является тирозил- аденилат (Tyr-АМР): Cys35, Thr51 и His48 Фермент из B. Stearothermophilus был закристаллизован. В том числе было показано, что при образовании промежуточного продукта реакции аминоацилирования тРНК – тирозиладенилата водородные связи с остатком рибозы тирозиладенилата образуют боковые радикалы остатков Cys35, Thr51 и His48. Е + АТР + Tyr E·[АМР~Tyr] + pp i E + Tyr~тРНК Tyr + АМР тРНК Tyr

13 Водородные связи между тирозил-тРНК- синтетазой и тирозил-аденилатом Прямоугольниками и шрифтом синего цвета обозначены аминокислотные остатки, подающие для образования водородных связей группы основной цепи.

14 Роль Cys35 в активности фермента Cys35 Gly35 и Cys35Ser35 Сродство к субстрату АТР (k cat /К М реакции аминоацилирования) снижалось для обоих мутантов, как для первого, лишенного потенциальной возможности образовывать водородную связь за счет удаления -SH группы, так и для второго, у которого –SH группа заменена на –ОН группу. Фермент с заменой на Ser35 обладал более низким сродством к субстрату АТР, чем фермент с заменой на Gly35, хотя замена на Ser35 оставляет возможность образования водородной связи. Возможно, это наблюдается из-за более прочного образования водородной связи мутанта Cys35Ser35 с молекулой воды, что затрудняет образование фермент- субстратного комплекса.

15 Роль Cys35 в активности фермента Cys35Ala Эта замена позволяет определить роль –SH группы цистеина в функционировании активного центра фермента. Так согласно данным РСА –SH группа цистеина расположена близко от 3-ОН группы субстрата, значит между этими двумя группами может образоваться водородная связь. Однако с помощью РСА не удается подтвердить наличие этой связи. При замене на Ala величина К М упала в 20 раз, а величина k cat для реакции активации аминокислоты (т.е. для АТР) упала в 2 раза. Эффективность реакции (k cat /К М ) образования аминоациладенилата увеличилась в 10 раз, в основном за счет снижения К М. Вероятно, в этом случае повышение эффективности реакции происходит за счет наличия водородной связи в ферменте дикого типа.

16 Роль Thr51 в активности фермента C помощью РСА было показано, что –OH группа бокового радикала аминокислотного остатка Thr51 образует слабую водородную связь с АМР. В отсутствие субстрата, однако, –OH группа Thr51 образует прочную водородную связь с молекулой воды, что способствует диссоциации комплекса фермент- субстрат. Замена Thr51 Ala привела к незначительным изменениям величин параметра k cat обеих реакций, но повлияла на сродство фермента к АТР, увеличив его, поскольку К М снизилась в два раза. Соответственно увеличились вдвое величины параметров k cat /К М. Это согласуется с предположением, что незначительное повышение сродства фермента к субстрату может достигаться удалением слабой водородной связи с субстратом в активном центре.

17 Роль Thr51 в активности фермента В структуре гомологичного фермента тирозил-тРНК-синтетазы из E.Coli остаток Thr51 заменен на пролин, и это вызывает изгиб полипептидной цепи (нарушение структуры α-спирали). У мутантного фермента из B. Stearothermophilus с заменой Thr51Pro51 водородная связь с кислородом рибозного кольца образовываться не может. Такая мутация привела к значительным изменениям величин кинетических параметров. Для первой реакции образования аминоациладенилата значение величины k cat выросло почти в два раза, тогда как для реакции аминоацилирования – упало в 2,6 раза. Сродство фермента к АТР (К М ) повысилось в обоих случаях – в 15 и 130 раз соответственно. Для обеих реакций повысилась их эффективность (k cat /К М для АТР), наблюдался соответственно 25- и 50-кратный рост каталитической эффективности ферментативной реакции, в основном за счет снижения К М для АТР.

18 Кинетические параметры реакции образования аминоациладенилата для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и мутантных форм фермента Ферментk cat (с -1 ) К М для АТР (мМ) k cat /К М (с -1 М -1 ) WT (Thr51)7,60,98,4 Ala518,60,5415,9 Pro5112,00,058208,0

19 Кинетические параметры реакции переноса аминоацильного остатка на тРНК для тирозил-тРНК-синтетазы дикого типа и мутантных форм фермента Ферментk cat (с -1 ) К М для АТР (мМ) k cat /К М (с -1 М -1 ) WT (Thr51)4,72,51,86 Ala514,01,23,20 Pro511,80,01995,8

20 Развитие сайт-направленного мутагенеза, модификации и усовершенствования С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК. В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) dNTP, причем один из них – в высокой концентрации. Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида, что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов. В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы. С помощью метода ПЦР можно получать множественные мутации в конкретных участках ДНК. В этом случае амплификацию мутагенизируемого сегмента ДНК производят в присутствии трех (вместо четырех) dNTP, причем один из них – в высокой концентрации. Именно этот нуклеотид преимущественно включается в амплифицируемый фрагмент ДНК вместо недостающего нуклеотида, что сопровождается накоплением в ДНК-продукте множественных случайных мутаций в виде соответствующих замен нуклеотидов. В таких искусственных условиях мутации возникают за счет снижения точности функционирования ДНК- полимеразы. При использовании в ПЦР вырожденных праймеров, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, можно сканировать мутациями определенные участки ДНК. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно получать делеции и вставки. Целенаправленно получать точковые мутации, делеции и вставки, а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК- лигазы, можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров. При использовании в ПЦР вырожденных праймеров, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, можно сканировать мутациями определенные участки ДНК. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно получать делеции и вставки. Целенаправленно получать точковые мутации, делеции и вставки, а также гибридные молекулы ДНК без применения ДНК- лигазы, можно с применением подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров.

21 Метод амбер-супрессии с использованием аминоацилированных различными аминокислотами супрессорных тРНК, которые узнают нонсенс-триплеты в мутантных мРНК в процессе трансляции Замена определенных аминокислот в полипептидных цепях белков in vivo. Взамен аминокислоты, присутствующей в белке дикого типа, встраивается аминокислота, которую несет аминоацилированная супрессорная тРНК. В дополнение к природным супрессорным тРНК E. coli синтезированы in vitro гены, кодирующие супрессорные РНК новой специфичности. В итоге в синтезирующейся in vivo полипептидной цепи в результате супрессии кодона UAG (amber) может быть произведено до 13 аминокислотных замен. С использованием такого подхода удалось произвести >1600 замен аминокислот Lac-репрессора E. coli и локализовать участки полипептидной цепи, существенные для связывания индуктора, прочного связывания оператора и термостабильности белка. Преимущество метода: не требует синтеза большого числа мутантных генов и их последующего отбора, так как введение одного мутантного гена в составе экспрессирующего вектора в клетки разных супрессорных штаммов E. Сoli позволяет получать разные замены аминокислот с одновременной сверхпродукцией мутантного белка в бактериальных клетках.

22 Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена – совокупность таких подходов получила название обратной генетики.Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена – совокупность таких подходов получила название обратной генетики. Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой, а также объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили, по сути дела, конструировать in vitro новые белки, не встречающиеся в природе, и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления – белковой инженерии.Возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой, а также объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили, по сути дела, конструировать in vitro новые белки, не встречающиеся в природе, и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления – белковой инженерии.