Лекция 11. Молекулярные основы генетической коррекции и генотерапии. - презентация

1 Лекция 11. Молекулярные основы генетической коррекции и генотерапии

2 Генная инженерия – это набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкций Задачи генной инженерии: создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов Рекомбинантные ДНК создаются для определенных научных целей

3 Генная инженерия является основой: биотехнологических процессов картирования хромосом секвенирования геномов коррекции генома и генотерапии

4 Первые рекомбинантные ДНК называли химерами (1973) Рекомбинантные ДНК состоят из фрагментов ДНК, полученных от разных организмов например, ДНК бактерии, вируса и человека

5 Принципы генетической инженерии Конструирование рекомбинантных молекул ДНК Перенос ДНК в клетки-реципиенты Селекция и отбор трансформированных клеток Клонирование рекомбинантной ДНК в клетках хозяина

6 Концепция создания рекомбинантной ДНК: вектор – вставка Вставка – это чужеродная ДНК, встроенная в вектор Вектор – это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина с целью ее размножения и клонирования

7 Для вставки используют: Геномную ДНК, выделенную из клеток Гены, синтезированные in vitro Копии ДНК (кДНК), полученные с помощью фермента обратной транскриптазы на РНК-матрице

8 Характеристика вектора: Вектор должен содержать точку начала репликации (origin) для самостоятельной репликации в клетке- хозяине Вектор должен иметь два селективных маркера для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина

9 В качестве генетических векторов используют: Плазмиды Космиды (плазмиды, которые содержат cos-сайты фага ) Бактериофаги Вирусы Yac (yeast artificial chromosomes) – искусственные хромосомы дрожжей

10 Строение плазмидного вектора

11 Основные ферменты, используемые в генной инженерии: Эндонуклеазы рестрикции ДНК-лигазы Обратная транскриптаза Taq-полимераза Концевая трансфераза ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова) РНКаза Н

12 Рестриктаза EcoRI разрезает ДНК в палиндроме 5-G*AATTC-3 3-CTTAA* G-5

13 Схема строения плазмидного вектора

14 Схема лигирования фрагментов ДНК

15 Создание рекомбинанатной ДНК

16 Перенос рекомбинантной ДНК в клетку

17 Селекция трансформированных клеток

18 Клонирование рекомбинантной ДНК Клонирование – это получение большого количества копий определенного гена в результате его размножения в клетках в составе рекомбинантной ДНК Клон – это популяция клеток, которая берет начало от одной клетки

19 Трансформация – изменение свойств клетки в результате переноса рекомбинантной ДНК через мембрану Скрининг – поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди десятков тысяч клонов

20 Основные методы скрининга: Блоттинг -гибридизация – метод, при помощи которого ДНК-мишень спаривается с комплементарным фрагментом ДНК (зондом) Зонды – это молекулы ДНК или РНК, меченные радиоактивными изотопами Скрининг – поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди тысяч клонов

21 Трансгенные организмы Трансгенез – перенос чужеродных генов в эмбриональные клетки организма Трансген – это чужой ген, перенесенный в новый организм посредством методов генной инженерии Для создания трансгенных животных и растений трансген должен наследоваться всеми клетками организма.

22 Получение трансгенных мышей методом генетичеcкой модификации эмбриональных стволовых клеток (М.Эванс, 1981 г.)

23 Трансгенная мышь содержит ген соматотропина крысы (1982 г.)

24 Генная терапия - новое направление лечения наследственных болезней человека Генная терапия – коррекция мутантных генов или нарушений клеточных функций с помощью методов генной инженерии

25 Трансгенные эксперименты на человеке запрещены Генотерапия основана на введении нормальной копии гена в соматические клетки костного мозга, фибробласты кожи, миобласты, гепатоциты или лимфоциты пациента Генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток не проводится

26 терапевтическая генно-инженерная конструкция содержит терапевтический ген для коррекции мутантного гена подходящий вектор тканеспецифический промотор селективный маркер для отбора трансформированных клеток

27 Генно-инженерная конструкция для коррекции наследственного иммунодефицита LTR ADA neo ген ADA (ДНК человека) - кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы ген neo (ДНК бактерии) – контролирует устойчивость клеток к антибиотику неомицину, LTR (ДНК ретровируса) – длинные концевые повторы, содержат промотор для экспрессии терапевтического гена в лимфоцитах

28 Векторы, используемые в генотерапии Ретровирусы – поражают миобласты, фибробласты, гепатоциты, гематопоэтические и стволовые клетки Аденовирусы – поражают клетки слизистой оболочки дыхательных путей Аденоассоциированные вирусы - интегрируют в специфический участок 19 хр. Герпесвирусы –инфицируют нейроны и другие клетки

29 Генная терапия ex vivo: 1. получение от пациента клеток с генным дефектом 2. перенос терапевтической генной конструкции в изолированные клетки; 3. отбор, выращивание и тестирование трансфицированных клеток; 4. трансплантация или трансфузия трансфицированных клеток пациенту

30 Генная терапия in vivo: ген Х кодирует белок, корректирующий наследственный дефект ген Х доставляется в организм пациента и экспрессируется в клетках ткани Х экспрессия гена Х происходит только в ткани Х, т.к. промотор р тканеспецифичен

31 Микроинъекция ДНК в ткани

32 Метод электропорации – высокое напряжение увеличивает проницаемость мембраны

33 Методы доставки генно-инженерных конструкций в клетки-мишени Физические методы: Микроинъекция Электропорация с помощью аэрозолей Биологические методы : эндоцитоз липосомы нановекторы на основе желатина

34 Агрессивная генотерапия для коррекции онкологических заболеваний: Уничтожение опухоли - в лимфоциты переносят ген TNF (фактор некроза опухолей) с увеличенной активностью Активизация иммунной системы - инъекция в опухоль липосомно-плазмидного комплекса, который содержит ген, кодирующий синтез чужого антигена HLA-B7 Отключение кровоснабжения опухоли - в кровь вводят терапевтический ген, контролирующий синтез специального белка