ДНК диагностика фитопатогенов. Методы диагностики Визуальный Индикаторные растения Электронная микроскопия Серологическая диагностика ДНК диагностика. - презентация

1 ДНК диагностика фитопатогенов

2 Методы диагностики Визуальный Индикаторные растения Электронная микроскопия Серологическая диагностика ДНК диагностика

3 Полимеразная цепная реакция – ПЦР Традиционная ПЦР ПЦР в реальном времени Детекция после ПЦР (end-point detection) Биочипы

4 ДНК диагностика Сбор материала Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) Постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) Регистрация сигнала Обработка результатов

5 Полимеразная цепная реакция – ПЦР После проведения реакции из одной молекулы ДНК образуется миллионы идентичных копий

6 ДНК диагностика 1.Диагностика урогенитальных инфекций (хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, кандидоз и др.). 2.Вирусные заболевания (гепатиты В и С, вирус папилломы человека, ВИЧ). 3.Детекция микобактерий туберкулеза. 4.Изучение экспрессии генов в различных тканях 5.Анализ SNPs. 6.Детекция трансгенов. 7.Применение в селекции растений. 8.Детекция фитопатогенов.

7 Детекция фитопатогенов Контроль безвирусного посадочного материала Детекция вироидов Детекция фитоплазм Детекция вирусов в насекомых- переносчиках

8 Используется с 1995 г.

9 Диагностика должна быть: Быстрой Дешевой Точной Чувствительной Широко применимой Воспроизводимой

10 Подходы к диагностике Одновременный анализ большого количества образцов на один фитопатоген Анализ в одном образце большого числа фитопатогенов

11 Традиционная ПЦР 1.Быстрота анализа. 2.Высокая точность. 3.Воспроизводимость. 4.Простота, легкость в применении. Широкое распространение

12 Недостатки традиционной ПЦР 1.Длительность. 2.Высокий риск контаминации. 3.Высокие затраты при массовых анализах. 4.Ядовитые реагенты (EtBr). 5.ТРУДОЕМКОСТЬ

13 1.Молекулярные беконы – структура шпильки. 2.TaqMan-зонды – линейные зонды (Roche Diagnostics). 3.«Скорпион»-зонды – структура шпильки и билинейная (Invitrogen). ПЦР в реальном времени

14 Молекулярный бекон (Molecular Beacon).

15 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ БЕКОНЫ

16

17 TaqMan-зонд - в процессе проведения ПЦР происходит освобождение флуоресцентной метки ДНК-зонд гибридизуется с амплифицируемой последовательностью ДНК-зонд в процессе амплификации разрушается ДНК- полимеразой и метка начинает флуоресцировать

18 «СКОРПИОН»-ЗОНДЫ

19 Сравнение технологий

20 Используя разные флуоресцентные метки можно детектировать в пробирке разные ПЦР продукты

21 Детекция флюоресценции Детекция в режиме реального времени (Real-time PCR) Детекция после ПЦР (end-point detection)

22 Детекция флюоресценции Real-time PCREnd-point detection

23 Преимущества ПЦР в реальном времени: - все операции проводятся в одной пробирке; - исключается риск контаминации ПЦР- смеси и продуктов; - быстрота анализа; - возможность автоматизации; - экономия затрат времени и труда.

24 Преимущества ПЦР в реальном времени: Чувствительность В раз более чувствительнее чем ELISA В 100 раз более чувствительнее чем обычный ПЦР

25 Детекция вироида веретеновидности клубней картофеля PSTVd

26 Детекция вироида веретеновидности клубней картофеля PSTVd кДНК РНК ОТ-ПЦР Real-time PCR или End-point detection

27 F R PSTVd Детекция картофельного вироида PSTVd

28 F R COX

29 Детекция картофельного вироида PSTVd

30 Детекция вирусов X и Y картофеля Детекция вируса Y Детекция вируса Х

31 Детекция вирусов картофеля Сокращение времени детекции в 2 раза Детекция вируса Х картофеля с помощью Real-time ПЦР

32 Диагностикумы Картофель: Вирусы Х и Y, вирус скручивания листьев картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля Земляника: вирус кольцевого пожелтения жилок листа, вирус крапчатости листьев, вирус слабого краевого пожелтения листа, вирус морщинистости листьев земляники, микоплазмы; Огурец: Вирус огуречной мозаики, вирус зеленой крапчатой мозаики.

33 Возможность использования в полевых условиях

34 Экстракция ДНК ПЦР

35 Биочипы Возможность одновременно детекции более мишеней

36

37 Центр молекулярной биотехнологии