{ Применение скрининговых методов при государственном мониторинге пищевой продукции и кормов Ирина Нестеренко в.н.с. отдела безопасности пищевой продукции. - презентация

1 { Применение скрининговых методов при государственном мониторинге пищевой продукции и кормов Ирина Нестеренко в.н.с. отдела безопасности пищевой продукции ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации средств для животных и кормов» ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

2 Классификация методов, применяемых при мониторинге пищевой продукции и кормов Классификация методов, применяемых при мониторинге пищевой продукции и кормов Виды скрининговых методов Виды скрининговых методов Скрининговые методы, разрабатываемые и применяемые в ФГБУ «ВГНКИ» Скрининговые методы, разрабатываемые и применяемые в ФГБУ «ВГНКИ» План

3 Приоритетные ксенобиотики Хлорамфеникол Тетрациклины Бацитрацин Аминогликозиды β-лактамы Хинолоны Сульфаниламиды Нитрофураны Кокцидиостатики Макролиды β-адреностимуляторы Нитромидазолы Карбадокс, олаквиндокс Полимексины Цефалоспорины

4 Классификация методов СКРИНИНГ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ Стратегия контроля остаточного содержания лекарственных средств в кормах и животноводческой продукции включает использование скрининговых и подтверждающих методов.

5 Скрининговые методы Скрининговый метод: используется для определения присутствия соединения или класса соединений на определенном уровне. Согласно Решению Комиссии 2002/657/ЕС Основная задача: анализ большого количества образцов для отбора потенциально несоответствующих из большого количества проб

6 Биологические методы обнаруживают клеточные ответы на анализы (например, эстрогенный эффект, торможение роста бактерий, клеточный эффект, гормональный эффект.) Биохимические методы обнаруживают молекулярные взаимодействия (например, антигены, белки) между анолитами и антителами или рецепторными белками (ИФА, радиоиммуноанализ) Физико-химические методы различают химическую структуру и молекулярные характеристики анализов путем разделения молекул Классификация скрининговых методов По принципу обнаружения:

7 Качественные методы дают ответ да/нет без указания концентрации анализируемого вещества Качественные методы дают ответ да/нет без указания концентрации анализируемого вещества Полуколичественные методы дают примерное указание на концентрацию предполагаемого анолита Полуколичественные методы дают примерное указание на концентрацию предполагаемого анолита Количественные методы соответствуют тем же требованиям к точности, динамическому диапазону и прецизионности, что и подтверждающие методы Количественные методы соответствуют тем же требованиям к точности, динамическому диапазону и прецизионности, что и подтверждающие методы Классификация скрининговых методов По степени количественного определения :

8 Примеры скрининговых методов Микробиологические методы Иммунохимические методы Хроматографические методы

9 Иммунохимические методы + Y Y Инструментальные иммуноферментный анализ, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, капиллярный иммуноэлектрофорез Неинструментальные различные виды иммунохроматографических тест-методов: тест-полоски, тандемные колонки, иммунофильтрационный

10 Иммунохроматографические методы образецYYY конъюгатантитело-золото конъюгатаналит-белок антивидовые антитела адсорбционная мембрана YYY положительный образец YYY отрицательный образец

11 Тест-полоски (стрептомицин, пенициллин, хлорамфеникол и др.) Тест-полоски (стрептомицин, пенициллин, хлорамфеникол и др.) Иммунофильтрационные тесты Иммунофильтрационные тесты Иммунохроматографические методы

12 Иммуноферментный анализ Конкурентный ИФА Непрямой YY Y Y Y YY E S P YY E Y Y Y Y E Y Y E Прямой E E S P Y Y Y E Y Y Y E

13 Хлорамфеникол-ИФА Хлорамфеникол-ИФА Тетрациклины-М-ИФА Тетрациклины-М-ИФА Фторхинолоны-ИФА Фторхинолоны-ИФА Энрофлоксацин-ИФА Энрофлоксацин-ИФА Фуразолидон-ИФА Фуразолидон-ИФА Тренболон-ИФА Тренболон-ИФА Иммуноферментный анализ Тест-системы, разрабатываемые в ФГБУ «ВГНКИ» Производитель: ЗАО «НВО «Иммунотех», г. Москва В процессе разработки: Трифенилметановые красители -ИФА Карбадокс-ИФА Никарбазин-ИФА

14 Хлорамфеникол-ИФА Предел количественного определения: 0,3 мкг л -1 для молока и сливок; 0,3 мкг кг -1 для мяса и яиц Условия инкубации (время, температура) : - инкубация 1 час при +37 °С; - инкубация с ТМБ 15 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 1,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев. МУК Регистрационное свидетельство ПВР-1-7.8/02280

15 Тетрациклин-М-ИФА Предел количественного определения: 1 мкг/л для молока; 10 мкг кг -1 для сухого молока Условия инкубации (время, температура) : -инкубация 1,5 часа при +37 °С; -инкубация 1 часа при +37 °С - инкубация с ТМБ 15 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 4 часа (с учетом времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев. Регистрационное свидетельство ПВР-1-8.9/02460

16 Тренболон-ИФА Свидетельство о государственной регистрации ПВР-1-1.5/01469 ГОСТ Р –2009 ПРОДУКЦИЯ ЖИВОТНОВОДСТВА И КОРМА. Иммуноферментный метод определения синтетических анаболических стимуляторов роста Предел количественного определения: в моче - 1,0 мкг л -1 ; в мышечной ткани - 1,0 мкг кг -1 ; в печени - 1,0 мкг кг -1. Условия инкубации (время, t о С) : - инкубация 1 час при +37 о С; - инкубация с ТМБ 15 мин при +37 о С. Время проведения анализа: 3,0 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 10 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

17 Энрофлоксацин-ИФА ФторхинолонCR*, % энрофлоксацин 100 ципрофлоксацин 2 % др. фторхинолоны*< 0,1 % CR – процент перекрестного реагирования **Др. фторхинолоны – норфлоксацин, флюмеквин, сарафлоксацин, марбофлоксацин, дифлоксацин, дан офлоксацин, ломефлоксацитн Предел количественного определения: в молоке - 1,0 мкг л -1 ; в рыбе- 1,0 мкг кг -1 ; в мясе - 1,0 мкг кг -1. Условия инкубации (время, t о С) : - инкубация 1 час при +37 о С; - инкубация с ТМБ 10 мин при +37 о С. Время проведения анализа: 2,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

18 Фторхинолоны-ИФА Предел количественного определения Молоко, мясо, яйца, рыба – 5 мкг кг -1 Специфичность ФторхинолонCR*, % энрофлоксацин 100 ципрофлоксацин 100 дан офлоксацин 38 норфлоксацин 8 офлоксацин 5 ломефлоксацин 20 сарафлоксацин 12 Др. фторхинолоны**< 1 * CR – процент перекрестного реагирования **Др. фторхинолоны – флюмеквин,, марбофлоксацин, дифлоксацин

19 Фуразолидон-ИФА Предел количественного определения: 1 мкг л -1 для молока и сливок; 1 мкг кг -1 для мяса и яиц Условия инкубации (время, температура) : - инкубация 1 час при +25 °С; - инкубация с ТМБ 10 мин при +(18-25)°С. Время проведения анализа: 1,5 часа (без учета времени пробоподготовки). Количество анализируемого образца: 50 мкл. Количество анализов: тест-система рассчитана на проведение анализа в дубликатах 42 исследуемых образцов и 6 калибровочных растворов, всего 96 определений. Срок годности набора: 6 месяцев.

20 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ Новая тенденция при создании скрининговых методов – разработка экспрессных методик, время анализа в которых занимает менее 10 минут. К таким методам относится поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), выгодно отличающийся быстротой проведения реакции и возможностью ее автоматизации Принцип метода: конкуренция между антигеном и меченным флуоресцентной меткой антигеном за центры связывания антител F F F F F Y Y Y Y Y Y Y Y Y F F F Y измерение Y Y Y Y F F F Y F Y - антиген - антиген, меченный флуоресцентной меткой (трейсер) - антитела

21 Принцип поляризации флуоресценции Деполяризованный свет Поляризатор Поляризованный свет трейсер (быстрое вращение) Излучаемый свет деполяризован Высокая поляризация флуоресценции Низкая поляризация флуоресценции Излучаемый свет поляризован

22 Оборудование 1 образец – 10 с 10 образцов – 7 мин 40 образцов – 5 мин Один образец Карусель из 10 образцов Планшетный формат

23 Тест-системы для определения микотоксинов в кормах Тест-система Диапазон концентраций, мкг кг -1 Специфичность, % Зеараленон-ПФИА3-40 Зеараленон – 100 α-зеараленол – 40 зеранол -– 25 ДОН-ПФИА ДОН – ацетил-ДОН – 90 Ниваленол –

24 Скрининговые методы используются для определения присутствия соединения или класса соединений на определенном уровне. Арбитражные (или подтверждающие) применяют для подтверждения результатов скрининга В ФГБУ «ВГНКИ» создана система скрининговых (иммунохимических и хроматографических) и подтверждающих (хроматомассспектрометрических) методов определения остаточного содержания ряда ветеринарных лекарственных средств, в частности для определения антибиотиков тетрациклиновой группы, фторхинолонов, хлорамфеникола и др. Разработано 6 тест-систем ИФА для определения хлорамфеникола, тетрациклинов, фторхинолонов, нитрофуранов и тренболона, а также 4 тест-системы для экспрессного определения: зеараленона, ДОНа, охратоксина А и афлатоксина В 1 методом ПФИА. Нормативная документация на тест-системы рассмотрена и утверждена на ТК 454 «Охрана жизни и здоровья животных и ветеринарно-санитарная безопасность продуктов животного происхождения и кормов» Резюме

25 Спасибо за внимание! ФГБУ «ВГНКИ» ФГБУ «ВГНКИ» Отдел безопасности кормов и пищевых продуктов Звенигородское шоссе, 5 Москва Россия +7(499) ЗАО «НВО Иммунотех» , г. Москва, ГСП-1, МГУ имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, д.1, строение 11А +7 (495)

26 Фуразолидон-ПФИА Фуразолидон-ПФИА Хлорамфеникол-ПФИА Хлорамфеникол-ПФИА Тетрациклин-ПФИА Тетрациклин-ПФИА Никарбазин-ПФИА Никарбазин-ПФИА Тест-системы в процессе разработки Целевая матрица- корма