МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме: «Технология культуры изолированных. - презентация

1 МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме: «Технология культуры изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных сортов ячменя» гос. регистрации 0112РК02744

2 - Повышение частоты регенерации in vitro сортов ячменя в культуре изолированных микроспор; -Оптимизация параметров культуры клеток и регенерации растений in vitro; - Отработка первичного протокола культуры микроспор ячменя Задачи исследований: - Отбор сортов ячменя для улучшения биотехнологическими методами. Выбор условий для дигаплодизации генотипов ячменя в массовых масштабах. - Цитологические методы определения плоидности растений. - Отработка эффективной технологий ускоренной гомозиготизации генотипов ячменя (культура микроспор). - Разработка культур микроспор выбранных сортов, регенерация растений, удвоение хромосом.

3 1. длина верхнего междоузлия – см, длина колоса – см 2. длина верхнего междоузлия – 9,5-12,5 см, длина колоса – см Рисунок 1. 9,5-12,5 cм cм

4 РИСУНОК 2. Микроспоры: A - свежевыделенные; B - после деления

5 Рисунок 3. 1 – эмбриоидо- подобные структуры (каллусы, эмбриоиды) на питательной среде 2 – меристемати- ческие очаги на регенерационной питательной среде

6 Рисунок 4. 1 – растения на питательной среде для регенерации 2 - доращивание растений- регенерантов в грунте

7 Сорта и линии ячменя Фаза развития микроспор % пыльников с новообразованиями поздняя одно- ядерная ранняя дву- ядерная поздняя одно- ядерная ранняя дву- ядерная Айдын ± ± 0.06 Байшешек ± ± 0.14 Береке ± ± ± ± 0.39

8 Вариант опыта Количество новообра- зований, шт. Частота регенерации Количество зеленых растений Количество альбиносов штук% % % 6% сахароза ,77580,51919,5 6% мальтоза 9567,473,46498,421,6 6% сахароза+ актив. уголь ,81044,11556,8 F факт. --24,2-22,6- НСР ,4-13,1-

9 Компоненты средымг/л KCl1490 MgSO 4 x 7H 2 O250 CaCl 2 x H 2 O150 Маннитол (0.3 M) pH=7.0

10 Компоненты средымг/л KNO (NH 4 ) 2 SO KH 2 PO CaCl 2 x2H 2 O166 MgSO 4 x 7H 2 O185 Fe-EDTA5 мл из 100-x MS B5-витамины1 мл из 1000-x стока B5 микросоли1 мл из 1000-x стока Мальтоза МЕС буфер1950 Глютамин500 pH=6,2

11 Рисунок диплоид, 2 – гаплоид 1 2

12 1 этап – Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий: отбор растений в поздней одноядерной стадии развития микроспор, предобработка изолированных колосьев низкими температурами при +4°+5°C в течение суток. 2 этап - Выделение и обработка пыльников: стерилизация колосьев, выделение пыльников на жидкую питательную среду В. Цитологический анализ. 3 этап – Изолирование и очищение микроспор: гомогенизация (300об/мин х 90сек), фильтрация, центрифугирование (900об/м х 3мин), флотирование интактных клеток в градиенте 20% мальтозы, центрифугирование (850об/м х 5мин), смешивание фракции микроспор со средой. Инкубирование эксплантов в темноте 28 дней при 25°C.

13 4 этап – Деление микроспор и разбавление культуральной среды: после 1-ой недели микроспоры начинают делиться и образуют колонии, каллусы и эмбриоиды. В чашки Петри добавляют среды А с уменьшенным содержанием мальтозы (20 мг/л). 5 этап - Регенерация и укоренение: пассирование эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду (MS соли + витамины + 0,1мг/л зеатина + 0,01мг/л гибберелловой кислоты). Через 3-4 недели образовавшиеся растения-регенеранты переносятся на среду для укоренения (1/2 MS соли + витамины + 15 г/л сахарозы). 6 этап – Удвоение хромосом. Контроль уровня плоидности. Пересадка в грунт, опрыскивание раствором ГК. Получение семенного материала. Кариологический и биохимический контроль полученных дигаплоидов.

14 - Приготовление питательных сред и стерилизации материала, инструментов по Ф.Л.Калинину и др., Выделение микроспоры и получение гаплоидов ячменя по методам гаплоидной технологии по А.М.Тураеву и др., 1990; АЦФГР, Цитоэмбриологические анализы по методике З.П. Паушевой, Статистическая обработка – В.П.Доспехов 1987; Методика проведения НИР

15 - Выращивание донорных растений; - Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий; - Воздействие холодом (холодовой стресс) пыльников; - Стерилизация колосьев; - Выделение пыльников в асептических условиях; - Подготовка питательных сред; - Изолирование и очищение микроспор; - Наблюдения за делением микроспор; - Перенос эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду; - Колхицинирование гаплоидных растений ячменя; - Высадка регенерантов в грунт.

16 1. Заявление на патент РК на изобретение в РГКП «НИИС» Способ создания генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя на основе культуры изолированных микроспор. Регистрационный 2013/ от Башабаева Б.М., Абугалиева А.И., Исмагул А.Ж. 2. Башабаева Б.М. А.Ж. Исмагул, А.И. Абугалиева, Б.Ш. Алимгазинова, Б.С. Сариев. Культура изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя //Биотехнология. Теория и практика. Май

17 С П А С И Б О З А В Н И М А Н И Е!