Регуляция времени жизни клетки. Возможные пути гибели клетки. Апоптоз. Значение апоптоза для клинической медицины. профессор Бажукова Т.А., зав.каф.микробиологии, - презентация

1 Регуляция времени жизни клетки. Возможные пути гибели клетки. Апоптоз. Значение апоптоза для клинической медицины. профессор Бажукова Т.А., зав.каф.микробиологии, вирусологии и иммунологии

2 Апоптоз В каждой клетке есть своя собственная «гильотина», нож которой держится на не очень прочной «нитке» когда случается что-то экстраординарное в самой клетке или вокруг нее, нитка перерезается и гильотина падает, «аккуратно» лишая клетку жизни; соседние клетки пострадать не должны. Гибель отдельных клеток в организме воспринималась сугубо как дегенеративное явление, т. е. как процесс постепенного отмирания клеток в результате терминальной дифференцировки. Переворот во взглядах: погибать могут жизнеспособные клетки, т.е. клетки, которые еще не успели исчерпать свои жизненные ресурсы.

3 Апоптоз часто активную роль в своей гибели uграет сама клетка с помощью содержащихся в ней механизмов. Именно в результате этого переворота и возникло представление об апоптозе, или программированной клеточной гибели. Апоптоз - программированная клеточная смерть, в развитии которой активную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы.

4 Апоптоз «Апоптоз» по-гречески означает опадание листьев. Когда и при каких обстоятельствах в клетке включается программа апоптоза? Их можно разбить на две группы: а)«неудовлетворительное» состояние самой клетки ( «апоптоз изнутри») и б)«негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).

5 Апоптоз

6 «Апоптоз изнутри» Пусковые факторы и биологическая роль «Неудовлетворительное» состояние самой клетки. а)чрезмерные (нерепарируемые или плохо репарируемые) повреждения хромосом: многочисленные разрывы ДНК, нарушения ее конформации, сшивки между цепями, неправильная сегрегация хромосом и т. д. б) серьезные повреждения внутриклеточных мембран (митохондрий) в результате перекисного окисления их липидов.

7 «Апоптоз изнутри» Внешние факторы: разные виды облучений, изменения температуры, определенные химические соединения (цисплатин и др.), встраивающиеся в структуру ДНК, ингибиторы топоизомераз, они нарушают конформацию ДНК.

8 «Апоптоз изнутри» В делящихся клетках к вышеперечисленным факторам риска добавляется сам процесс деления. Действительно здесь аномалии структуры хромосом могут появляться просто в ходе сложнейших преобразований репликации хромосом, конденсации, сегрегации и т. д. Следовательно, деления повышают вероятность апоптоза. В результате на облучение особенно остро реагируют ткани с интенсивно делящимися клетками кроветворные и эпителиальные.

9 «Апоптоз изнутри» Линии половых клеток после полового созревания наблюдается массовая гибель клеток. Апоптоз выполняет одну и ту же функцию уничтожение дефектных клеток Отсюда вытекает важный вывод: повреждение клеточных структур, ведущее к апоптозу, не может быть чрезмерно сильным.

10 Апоптоз и некроз Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым и представляет собой уже некроз. В зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий, гибель клетки может пойти либо по апоптотическому («цивилизованному»), либо по некротическому («анархическому»)пути.

11 «Апоптоз по команде» Биологическая роль Вызывается внешней «негативной» сигнализацией, которая передается через мембранные или внутриклеточные рецепторы. 1. Клетка вполне жизнеспособна, но, с позиций целостного организма, она является ненужной или даже вредной. Поэтому ей посылается «черная метка», «повелевающая» умереть. Такой апоптоз закономерно связан с той или иной стадией онтогенеза: гибель клеток куколки в ходе метаморфоза насекомых, редукция пронефроса и ряда других зачатков в эмбриогенезе, исчезновение межпальцевых «перепонок» в ходе эмбрионального морфогенеза.

12 «Апоптоз по команде» 2. Другая группа «апоптоза по команде» касается формирования и функционирования иммунной системы: уничтожение аутореактивных клонов Т и B- лимфоцитов, гибель стимулированных антигеном лимфоцитов при длительном отсутствии антигена, гибель лимфоцитов под действием избытка гликокортикоидов: усиление катаболизма белков тканей направление высвобождающихся при этом аминокислот на гликонеогенез в печени : для снабжения жизненно важных органов (мозга и сердца).

13 «Апоптоз по команде» Многие элементы апоптоза присутствуют также в цитолитическом действии Т-киллеров на клетки-мишени. Fas рецептор клетки-мишени и (Fas-L) Т-киллеров при взаимодействии запускает в клетке-мишени процесс апоптоза. Тому же способствует и белок перфорин, который выделяется Т-киллером и образует каналы в плазмолемме клетки-мишени: через эти каналы в клетку проникают протеолитические ферменты гранзимы. Протеолиз, наряду с распадом нуклеиновых кислот, важнейшая составная часть апоптоза.

14 «Апоптоз по команде» Виды созревающих сперматогенных клеток: 1.сперматогонии (совершают митотические деления), 2.сперматоциты (проходят мейотические деления), 3.сперматиды (не делятся и подвергаются сложным морфологическим преобразованиям) 4.собственно сперматозоиды (оказываются в просвете канальцев и еще 1-2 недели дозревают в придатке семенника). Белки (антигенные детерминанты) еще не образовавшихся поздних сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов «не запечатлеваются» иммунной системой как «свои».

15 «Апоптоз по команде» Механизмы: 1.Гематотестикулярный барьер. Наиболее важная его часть образована отростками поддерживающих клеток (клеток Сертоли). Эти отростки соединяются друг с другом, разделяя два отсека. Перемещение созревших клеток из отсека в отсек происходит по принципу шлюзования. 2.Fas-Fas-L запускают апоптоз в клетке с Fas-рецептором

16 «Апоптоз по команде» 3.Третья группа «апоптоза по команде» относится к кроветворным клеткам всех рядов (лимфоидных и миелоидных). Для развития клеток каждого ряда необходимы определенные цитокины КСФ. В отсутствие же соответствующих факторов клетки, вступившие было в определенный путь развития, погибают. В них запускается механизм апоптоза. Таким образом, очевидно осуществляется регуляция гемопоэза.

17 «Апоптоз по команде» 4. Женская репродуктивная система: гибель клеток (ооцита и фолликулярных клеток) атрезирующих фолликулов, гибель клеток редуцирующегося желтого тела, гибель клеток функционального слоя эндометрия накануне менструации, гибель лактоцитов молочной железы после прекращения лактации (и т. д.). 5. Фактор некроза опухолей (ФНО) вызывает апоптоз в клетках, содержащих на поверхности рецептор R1-ФНО α. Этот феномен один из способов противоопухолевой защиты.

18 «Апоптоз по команде» «Апоптоз по команде» это инструмент, с помощью которого решаются многочисленные проблемы надклеточного уровня. «Апоптоз по команде» касается делящихся, или недавно делившихся, или еще способных к делению клеток. Апоптоз один из эффективных способов регуляции численности клеток.

19 Пусковые факторы «апоптоза по команде» Биологическая роль «апоптоза по команде», группируется по тканевому или органному признаку. Природа «негативной» сигнализации, запускающей апоптоз. - действие собственно негативного сигнала и - прекращение действия подкрепляющего, т. е. позитивного сигнала. Негативные сигналы: гликокортикоиды (в отношении лимфоцитов), а также мембраносвязанный Fas- лиганд (в отношении клеток с Fas-рецепторами). Сигнал от кадгеринов, при контактном торможении. Регуляция численности клеток в популяции.

20 Пусковые факторы «апоптоза по команде» Прекращение действия положительного сигнала. гибель начальных клеток кроветворных рядов в отсутствие КСФ гибель клеток функционального слоя эндометрия вследствие спада половых гормонов. Если нормальная клетка теряет связь с опорой, то перестают поступать положительные сигналы от интегринов. Поэтому содержание белка р53 возрастает и клетка не только прекращает делиться, но и вступает в апоптоз.

21

22 Морфология апоптоза а)Конденсация хроматина и некоторое сжатие клетки (из-за конденсации цитоплазмы) Хроматин приобретает вид плотных и резко очерченных гомогенных масс, расположенных по периферии ядра. Цитоплазма также несколько уменьшается в объеме, отчего клетка изменяет свою форму. Полагают, что причиной является образование перекрестных связей между цитоплазматическими белками, под плазмолеммой образуется что-то вроде дополнительной уплотненной оболочки.

23 Морфология апоптоза б)Фрагментация ядра и цитоплазмы с образованием апоптозных телец Ядро распадается на отдельные фрагменты, содержащие очень плотные массы хроматина. Образование глубоких впячиваний. Участки цитоплазмы приобретают вид лопастей. Клеточные фрагменты отшнуровываются и называются апоптозными тельцами.

24 Морфология апоптоза в) Фагоцитоз апоптозных телец окружающими клетками Соседние клетки распознают апоптозные тельца Фагоцитированные тельца быстро разрушаются в фаголизосомах. апоптозные тельца слущиваются в просвет соответствующего органа. Место, освободившееся в результате исчезновения клетки занимается сближающимися соседними клетками, сохранение прежней структуры ткани, либо формирование новой структуры.

25 Морфология апоптоза Наблюдается быстрый фагоцитоз, содержимое погибшей клетки в межклеточную среду не попадает и реакции воспаления не вызывает. Морфологические стадии апоптоза совершаются довольно быстро (за несколько часов). Поэтому при микроскопическом исследовании выявить клетки, находящиеся в процессе апоптоза, весьма проблематично.

26

27 Морфология некроза Некроз Некроз развивается при очень сильном повреждении клетки или столь же сильном изменении условий ее существования (прекращение кровотока в близлежащих сосудах). Это такие повреждения или условия, при которых механизмы апоптоза сработать не могут: либо они повреждены сами, либо клетка не имеет энергетических и пластических ресурсов для их функционирования.

28 Морфология апоптоза и некроза Некроз а)Уже на ранних стадиях повреждаются плазмолемма и другие мембраны. Их проницаемость для воды и для ионов повышается. б)Это вызывает набухание клетки в целом, ядра и других мембранных структур. Таким образом, объем клетки при некрозе возрастает (тогда как при апоптозе уменьшается).

29 Морфология апоптоза и некроза в) Из-за повреждения лизосомальных мембран происходит хаотичное самопереваривание клетки ферментами лизосом. г) Хроматин вовлекается в морфологически различимые события не сразу, а к середине или к концу процесса. Вначале он тоже конденсируется у ядерной мембраны. Но его массы значительно менее гомогенны и не так четко очерчены по краям, как при апоптозе.

30 Морфология апоптоза и некроза В результате кариолизиса хроматин исчезает (тогда как при апоптозе фрагменты хроматина оказываются в апоптозных тельцах). д)Заканчивается некроз разрывом плазмолеммы и высвобождением продуктов клеточного распада в межклеточную среду. Это вызывает, повреждение соседних клеток, начало воспалительного процесса (расширение сосудов, миграцию лейкоцитов и т.д.).

31 Морфология апоптоза и некроза Весь процесс некроза клетки может завершиться очень быстро за 1 ч. Но его последствия столь значительны, при микроскопическом исследовании случаи некроза наблюдают гораздо чаще, чем случаи апоптоза.

32

33

34 Этапы апоптоза

35

36 Непосредственные «орудия» апоптоза Цитоплазматические протеазы каспазы 1. Структура каспаз. Специальное семейство цитоплазматических протеаз (каспаз). Последние относятся к сериновым (или цистеиновым) протеазам по наличию в активном центре остатка соответствующей аминокислоты. Каспазы разрывают те пептидные связи, которые образованы с участием остатка аспарагиновой кислоты. Неактивные предшественники каспаз прокаспазы.

37 Каспазы При активации прокаспазы теряют N-концевой домен и расщепляются на две субъединицы большую и малую. Затем субъединицы собираются в тетрамерную структуру с двумя активными центрами. Всего в семействе каспаз 10 ферментов.

38 Каспазный каскад Каспазы способны в определенной последовательности активировать друг друга, образуя своего рода каскад, причем разветвленный. Под действием сигнала, идущего от плазмолеммы первой активируется каспаза 8. К активации каспаз могут приводить и факторы, высвобождающиеся из митохондрий (при повышении проницаемости мембран). Это протеаза AIF (2) (Apoptosis Inducing Factor) и цитохром с (3). 12 3

39 Каспазный каскад Протеаза AIF, видимо, непосредственно активирует (путем частичного протеолиза) каспазу 9. цитохром с, оказавшись в цитозоле, стимулирует взаимодействие с прокаспазой 9 белка Apaf-1.

40 Каспазный каскад Узловым звеном является каспаза 3. Она активируется и каспазой 8, и каспазой 9 Среди мишеней каспазы 3, видимо, присутствуют как другие компоненты каспазного каскада (каспазы 6, 7 и т. д.), так и некоторые некаспазные белки. Завершающие члены каскада иногда обозначаются как ICE (interleukin-converting enzymes). Главная их функция ограниченный протеолиз определенных белковых мишеней. *

41 Ингибиторы каспаз 3. Ингибиторы каспаз - белки семейства IAP (Inhibitors of Apoptosis). Их синтез стимулируется транскрипционным фактором NF-kB после его фосфорилирования протеинкиназой PKB/Akt. Протеинфосфатаза PTEN препятствует образованию ингибиторов каспаз. Апоптоз может развиваться лишь при достаточном содержании этого белка. * *

42 Активаторы и ингибиторы каспаз

43 Схема митохондриального апоптоза

44

45

46 Схема активации апоптоза 1 - взаимодействие лиганда с клеточным рецептором; 2 - высвобождение прокаспазы 8 и ее активация (сигнал клеточной смерти); 3 - появление факторов активации апоптоза (активная каспаза 8); 4, 5 - образование белков клеточной смерти (Bid, Bax), устраняющих защиту митохондриальной мембраны белком Bcl-2, препятствующим утечке цитохрома с; 6 - утечка цитохрома с из митохондрий и образование апоптосом с участием фактора Apaf-1; 7 - образование апоптосом и активация прокаспазы 9, активирующая каспазу 3, инициация апоптоза.

47

48 Мишени каскада 4. Все мишени каспаз не известны. В него входят и цитоплазматические, и ядерные белки. Активированные каспазы могут перемещаться из цитоплазмы в ядро. Ядерные белки составляют большинство мишеней каспаз. а)Цитоплазматические мишени: белки цитоскелета: фодрин и актин, регуляторные ферменты: фосфолипаза А, протеинкиназа С и т. д. С протеолизом фодрина связывают изменение поверхности клетки появление на ней впячиваний и выступов («гофрирование» плазмолеммы). Основную же роль в развитии апоптоза приписывают протеолизу ядерных белков.

49 Мишени каскада б) Гистон H и белок ламин В. Белки, фосфорилирование которых в профазе митоза приводит к конденсации хроматина и распаду ядерной оболочки на микропузырьки. В ходе же апоптоза наблюдаются сходные явления конденсация хроматина и фрагментация ядра. Объектом каспазного протеолиза является белковый комплекс, который называется конденсином и участвует в конденсации хромосом. *

50 Мишени каскада в) Ядерные мишени каспаз: ферменты репликации и репарации: топоизомеразы, ДНК-протеинкиназы, поли-АДФ- рибозилполимераза (ПАРП, участвует в «сшивании» разрывов в цепях); регуляторные белки например, белок pRb, контролирующий клеточный цикл; ингибиторы эндонуклеаз. *

51 Мишени каскада ДНК-протеинкиназы в результате действия каспаз активируются. После чего они, способны фосфорилировать белок р53, что приводит к активации этого белка. Таким образом, каспазный каскад, даже если он «запущен» без участия белка р53 (а такое возможно при «апоптозе по команде»), все равно способен вовлекать этот белок в процесс. Частичный протеолиз белка pRb приводит к ингибированию. Активирует транскрипционный комплекс E2F-DP и провоцирует вступление клетки в клеточный цикл. События же этого цикла сильный апоптогенный фактор. Ингибиторы эндонуклеаз. Протеолиз, видимо, «выключает» ингибитор, отчего активируются соответствующие структуры: в данном случае эндонуклеазы«орудие» апоптоза.

52 Эндонуклеазы В неизмененных клетках присутствует целый набор эндонуклеаз, различающихся и по механизму действия, и по функции. В цитоплазме содержатся ДНКазы I и II (деградация ДНК в разрушающейся клетке). При апоптозе «работают» ядерные эндонуклеазы, они разрушают ДНК не до нуклеотидов, а до крупных фрагментов. К ядерным нуклеазам относятся: репарационные эндо- и экзонуклеазы.

53 Эндонуклеазы Исследования ядерных эндонуклеаз у эукариот: если изолированные клеточные ядра инкубировать в буферной среде при температуре тела, то через некоторое время можно наблюдать (при электрофорезе выделенной ДНК), что ДНК распалась на фрагменты различной длины. Электрофоретическая «лесенка».

54 Эндонуклеазы Са2 +, Mg2 + - зависимая эндонуклеаза центральный фермент апоптоза. Данный фермент расщепляет ДНК хромосом не в случайных местах, а только в линкерных участках. Поэтому хроматин не подвергается полному лизису, а лишь фрагментируется, что, составляет отличительную черту апоптоза.

55 Эндонуклеазы Молекулярная масса этой Са2 +, Мg2 + - зависимой эндонуклеазы Да. В интактных клетках ее активность подавлена. Под действием индукторов апоптоза фермент высвобождается из этого комплекса и становится активным. 1)Роль индуктора выполняют каспазы. Активные каспазы поступают в ядро из цитоплазмы. Са2 +, Мg2 + - зависимая эндонуклеаза, активируется и в изолированных клеточных ядрах.

56 Эндонуклеазы Обнаружена другая Са2 +, Мg2 + - зависимая эндонуклеаза с молекулярной массой Да. Начальные стадии распада хроматина катализируются совсем иными нуклеазами, ядерная I-подобная ДНКаза, топоизомеразы и некоторые другие ферменты. Фрагментирование хромосомной ДНК важнейшая составная часть апоптоза.

57 Стадия инициирования

58 Стадия програмирования

59 Апоптоз

60 Другие «орудия» апоптоза Совокупность сильных окислителей. Есть два способа их накопления усиление продукции и торможение распада. При действии на клетку ФНО в ней активируется ген iNO-синтазы. Это ведет к избыточному накоплению оксида азота (NO), супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т. д. Все это создает в клетке «окислительный стресс». Особенно чувствительны к нему мембраны митохондрий и ядер. Через поврежденные мембраны митохондрий выходят факторы (протеаза AIF и цитохром с), которые активируют каспазный каскад. А через поврежденную ядерную оболочку каспазы легче проникают в ядро и активируют здесь эндонуклеазы (путем воздействия на их ингибиторы).

61 Другие «орудия» апоптоза В нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превращает супероксид в пероксид водорода), каталаза и пероксидаза (в свою очередь, элиминируют из среды пероксид водорода) и т. д. При апоптозе гены этих ферментов инактивируются

62 Другие «орудия» апоптоза Прямым «орудием» апоптоза являются белки, ответственные за изменение структуры плазмолеммы. С мембраной связан ряд ферментов, которые, способны при своей активации менять ее структуру. Транслоказа фосфатидилсерина, активируясь при апоптозе, выводит соответствующие липиды в наружный слой липидного слоя. У мембранных гликолипидов исчезают остатки сиаловой кислоты. В результате эта поверхность приобретает такие специфические «черты», которые для соседних клеток служат сигналом» к фагоцитозу. Целенаправленная реорганизация плазмолеммы при апоптозе призвана обеспечить его последнюю стадию поглощение апоптозных телец окружающими клетками.

63 Митохондриальные факторы В мембранах митохондрий находятся два белка протеаза AIF и цитохром с, которые активируют каспазу 9, а через нее весь каспазный каскад. 1. Каналы митохондриальных мембран. Проницаемость мембран для указанных факторов обусловлена наличием в мембранах специальных каналов. Состояние которых находится под с контролем группы белков семейства Всl2/Вах.

64 Митохондриальные факторы а)Белки Bcl-2, Bcl-x, A1/Bf11 в нормальных клетках находятся в составе митохондриальных мембран и закрывают вышеуказанные каналы. Получается, что они «грудью» защищают клетку от ничем не спровоцированного (т. е. спонтанного) апоптоза. Эти белки встроены в митохондриальные мембраны, гены их локализуются в ядерной ДНК.

65 Митохондриальные факторы б)Белки Вах, Bad, Bak, Bid относятся к тому же семейству, но выполняют прямо противоположную функцию стимуляцию апоптоза. При апоптогенных сигналах они перемещаются к митохондриальным мембранам, где способствуют открытию каналов для протеазы AIF и цитохрома с. белок Вах образует комплексы с белками Всl-2 и Bcl-х, в результате чего и происходит деблокирование каналов. Ключевую роль играет взаимодействие белка Вах с белком мембраны митохондрий VDAC.

66 Митохондриальные факторы Трансмембранный потенциал митохондрий. Происходящее при апоптозе повышение проницаемости мембран митохондрий, кроме выхода протеазы AIF и цитохрома с, имеет еще одно следствие падение трансмембранного потенциала. Создается градиент концентрации водородных ионов: внутри митохондрий концентрация протонов значительно ниже, чем снаружи. Внутри оказывается избыток отрицательных зарядов, а снаружи положительных, что и означает наличие трансмембранного потенциала.

67 Митохондриальные факторы Энергия протонного градиента используется для синтеза АТФ. Под действием апоптогенных сигналов белок Вах и его аналоги открывают в митохондриальной мембране каналы, протонный градиент исчезает и прекращается синтез АТФ в митохондриях. Падение трансмембранного потенциала митохондрий обычно рассматривают как одно из ведущих проявлений апоптоза.

68 Митохондриальные факторы Оно лишает клетку главного источника энергии. Апоптоз это энергозависимый процесс. Энергия требуется, в частности, для синтеза транскрипционных факторов и прочих регуляторных веществ, участвующих в развитии механизма апоптоза. Недостаток же энергии может нарушить «правильный» ход вещей и свести процесс к «некрасивому», «неупорядоченному» некрозу. Вовлечение в апоптоз митохондрий, способствует его развитию создает опасность перерождения апоптоза в некроз.

69 Митохондриальные факторы Регуляция митохондриальной «ветви» апоптоза. Продукция белков семейства Всl2/Вах и их функциональное состояние находятся под многосторонним контролем. а) Две протеинкиназы (ПК) способны фосфорилировать апоптогенный белок Bad (который относится к белкам, открывающим каналы) и тем самым его ингибировать: одна из этих ПК Raf, компонент каскада МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ); вторая протеинкиназа PKB/Akt. Эти две ПК образуют «заслон» на пути «несанкционированного» апоптоза. *

70 Митохондриальные факторы Raf коррелирует со стимуляцией митоза. PKB/Akt запускает ряд других механизмов антиапоптозного действия: активирует транскрипционный фактор из семейства NF-kB, стимулирующий ген белка A1/Bf11 одного из белков, закрывающих каналы. Фактор NF-kB (после фосфорилирования протеинкиназой PKB/Akt) стимулирует синтез ингибиторов каспаз (IAPs), что сдерживает апоптоз. * *

71 Митохондриальные факторы б) Антагонистом протеинкиназы PKB/Akt является является протеинфосфатаза PTEN. Она обеспечивает три механизма противоапоптозного влияния: дефосфорилирование и активирование белка Bad, открывающего митохондриальные каналы; дефосфорилирование и инактивирование транскрипционного фактора NF- kB, приводящее к снижению синтеза белка A1/Bf11, закрывающего каналы, и ингибиторов каспаз (IAP). *

72 Митохондриальные факторы Белок р53 - транскрипционный фактор, влияющий на активность генов апоптоза. Важнейшие среди этих генов которые кодируют белки, закрывающие и открывающие каналы митохондрий (белок р53): инактивирует гены белков (Всl-2, Bcl-х), закрывающих каналы, и активирует гены белков (Вах), открывающих каналы. *

73 Белок p53

74 Белок р53: саморегуляция содержания и активности Содержание белка р53 регулируется на уровне распада. Причем распад является убиквитин зависимым и происходит в протеосомах. Что касается активности этого белка, то способы ее регуляции достаточно разнообразны: это фосфорилирование и ацетилирование по целому ряду локусов. Данная система является саморегулирующейся; благодаря этому, в обычных условиях содержание и активность белка р53 поддерживаются на низком уровне.

75 Белок р53: саморегуляция содержания и активности а) Главный сдерживающий агент для фактора р53 белок Mdm2. Он является ингибитором фактора р53, снижает его активность. В комплексе с Mdm2 фактор р53 гораздо интенсивней выходит из ядра в цитоплазму, где у Mdm2 проявляется убиквитинлигазная активность в отношении р53. Таким образом, ускоряется и распад белка р53. Белок же р53 активирует ген белка Mdm2. В результате формируется прямая положительная связь: при избыточном накоплении белок р53 стимулирует (с помощью белка Mdm2) снижение своей активности и ускорение своего распада. *

76 Белок р53: саморегуляция содержания и активности б)Известен еще один регуляторный фактор белок ARF, или p19ARF. Связываясь с р53, он тормозит его распад. Имеется прямая положительная связь со стороны белка р53. Только теперь он выступает в качестве транскрипционного репрессора: угнетает активность гена белка ARF. Поэтому при высоком содержании фактора р53 количества белка ARF снижается, отчего ускоряется распад р53. *

77 Белок р53: саморегуляция содержания и активности Ген белка ARF имеет две «рамки считывания»: в одном случае начинает транскрибироваться с одного, а в другом случае с соседнего нуклеотида. разных белка. в)Белок 14-3-Зb служит активатором фактора р53. При чрезмерно высокой активности фактора р53 снижается содержание его активатора (белка 14-3-Зb), и активность р53 возвращается к нормальному низкому уровню *

78 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза Предапоптозные или премитотические состояния. В каждом случае на активность или содержание белка р53 влияют: повреждения ДНК. митогенные факторы

79 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза 1. «Апоптоз изнутри» повреждения ДНК. При накоплении в ДНК повреждений сигналы к р53 передаются тремя протеинкиназами а)ДНК-протеинкиназа (ДНК- ПК) регистрирует двухцепочечные разрывы, которые особенно интенсивно образуются при ионизирующих облучениях. После этого ДНК-ПК фосфорилирует, как сам белок р53 (активируя его), так и его ингибитор белок Mdm2 (снижая его сродство к р53). 1

80 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза б)Вторая протеинкиназа белок ATM. Она стимулируется после ионизирующего облучения и действует несколькими способами: непосредственно фосфорилирует определенный локус р53 (активация р53), способствует связыванию с р53 его активатора белка 14-3-Зb (путем дефосфорилирования другого локуса р53), активирует (путем фосфорилирования) тирозинкиназу с-Аbl, которая фосфорилирует еще один локус р53 и повышает активность этого белка. 2

81 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза в)Третья протеинкиназа казеинкиназа (КК). Она реагирует на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым светом. Далее : активация р53 путем фосфорилирования. Кроме этих ПК, имеется еще ряд факторов, участвующих в узнавании повреждений ДНК, возможно в их репарации, а при безуспешности в активации р53. Это белки BRCA1 и BRCA2. 3

82 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза 2. Митогенные факторы и «апоптоз по команде». Условия, необходимые для вступления клетки в очередной митотический цикл: действие ростового фактора, прикрепление клетки к внеклеточной опоре, отсутствие контакта с соседними клетками. При выполнении этих условий содержание фактора р53 в клетке уменьшается.

83 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза Изменение активности соответствующего гена происходит после запуска каскадов МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ) и образования промитотического комплекса транскрипционных факторов (ПМКТФ). Хотя бы одно из перечисленных условий выполняется, т. е. нет ростового фактора, потеряна связь с опорным субстратом или клетки контактируют друг с другом, содержание белка р53 возрастает и после достижения некоего критического уровня начинается «апоптоз по команде».

84 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза Вызываемые эффекты. Белок р53 стимулирует гены ряда «киллерных» рецепторов, т. е. рецепторов, воспринимающих команду об апоптозе. Белок Fas (Fas- рецептор) и рецептор KILLER/DR5. Повышается чувствительность клетки к соответствующим сигналам. * *

85 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза 2.Остановка клеточного цикла. Это происходит благодаря активации гена Р21, продукт которого (белок р21) ингибирует комплексы циклин-Cdk. Тому же способствует и активация гена GADD45. Белок Gadd45 ингибирует один из комплексов циклин-Cdks. Он связывается с белком PCNA, необходимым для репликации ДНК. *

86 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза 3.Активизация митохондриальной «ветви» апоптоза. а)Фактор р53 ингибирует гены тех белков (bcl-2, bcl-x), которые закрывают каналы в митохондриальных мембранах, и активирует гены белка (Bах), открывающего каналы. Через каналы выходят протеаза AIF и цитохром с, стимулирующие каспазный каскад. * *

87 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза б)Активируется и группа генов PIG. Их продукты способствуют накоплению в клетке активных радикалов и окислителей. Повреждаются мембраны митохондрий, что облегчает выход в цитоплазму протеазы AIF и цитохрома с. * *

88 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза 4.Воздействие на окружающие клетки. Белок р53 активирует продукты выделяющиеся из гибнущей клетки и воздействуют на ее окружение. Наблюдаются, по крайней мере, следующие два эффекта. а)Торможение ангиогенеза. Реализуется через гены TSP, BAS клетки с начавшимся апоптозом секретируют белки (тромбоспондин Tspl и т. д.), подавляющие новообразование сосудов в соседней ткани. Это лежит в русле важной функции апоптоза - ограничение опухолевого роста. *

89 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза б)Торможение пролиферации соседних клеток. Фактор р53 способствует также синтезу и секреции ряда ингибиторов пролиферации клеток (ß-ингибина и даже ФНОß, который не только останавливает деление окружающих клеток, но и запускает в них апоптоз. Этот эффект тоже один из ограничителей опухолевого роста.

90 Белок р53 - «диспетчер» апоптоза Белок р53 - ключевой «диспетчер» апоптоза, на котором сходятся многие (если не все) апоптогенные сигналы и от которого исходят многочисленные «команды» по «рядовым исполнителям».

91 Апоптоз

92 Схема «апоптоза изнутри» В развитии данного вида апоптоза выделяют 7 стадий: 1) Повреждение внутриклеточных структур особенно хромосом и мембран. 2) Передача сигналов (с помощью специальных протеинкиназ и других модифицирующих ферментов) на транскрипционный фактор р53. Модифицироваться может как сам белок р53, так и его ингибитор белок Mdm2. В любом случае достигается следующий результат повышение содержания (за счет замедления распада) и (или) активности фактора р53.

93 «Апоптоз изнутри» 3) Повышение проницаемости митохондриальных мембран благодаря влиянию р53 на гены семейства BCL-2, и непосредственного повреждения мембран. 4)Включение каспазного каскада. Частичный протеолиз каспазами многочисленных белков-мишеней.

94 Апоптоз изнутри» 5) Различные последствия частичного протеолиза: а) конденсация хроматина (результат протеолиза структурных белков гистона H1 и ламинов), б) активация ядерных эндонуклеаз (из-за протеолиза их ингибиторов) и в) изменение липидного состава плазмолеммы (по причине изменения активности ряда мембраносвязанных ферментов). Протеолиз может иметь последствия, которые придают апоптозу черты автокаталитического процесса путем усиления или повторного запуска некоторых его предыдущих стадий.

95 Апоптоз изнутри г) Частичный протеолиз ДНК- протеинкиназы тоже активирует этот фермент, отчего последний с новой силой влияет на содержание и активность фактора р53. д) Протеолиз белка pRb подавляет его ингибиторную активность в отношении транскрипционного фактора E2F-DP. Последний запускает клеточный цикл, репликацию ДНК. Что приводит к новым нарушениям их структуры и к повторной инициации «апоптоза изнутри».

96 Апоптоз изнутри 6)Действие эндонуклеаз постепенная фрагментация хроматина. 7) Завершающие морфологические преобразования: а) фрагментация ядер и цитоплазмы с образованием апоптозных телец б) фагоцитоз этих телец окружающими клетками. Составленная цепочка событий охватывает и объединяет все, что могло относиться к «апоптозу изнутри», от исходных пусковых причин до последних морфологически различимых стадий.

97 Повреждающие факторы Повреждение хромосом Увеличение содержания и активности белка р53 Открытие каналов в мембранах митохондрий Повреждение мембран Повышение проницаемости митохондриальных мембран Активация митохондриальными факторами (протеазой AIF и цитохромом с) каспазы 9 и каспазного каскада Частичный протеолиз ферментов репликации и репарации ДНК ЧП регуляторных белков pRb ЧП ядерных белков гистона Н и ламинов Ч П ингибиторов эндонуклеаз ЧП мембранных и цитоплазма- тических белков Провокация вступления клетки в митоз Конденсация хроматина Активация эндонуклеаз Фрагментация хроматина Фрагментация цитоплазмы Фрагментация ядер Изменение липидного состава плазмолеммы Фагоцитоз апоптозных телец соседними клетками Образование апоптозных телец

98 «Апоптоз по команде» I. Апоптоз при недостатке митогенных или при поступлении антимитогенных сигналов Апоптозу подвергается митотическая клетка. Причины апоптоза: а) к клетке перестал поступать ростовой фактор, б) клетка потеряла связь с опорным субстратом, в) клетка вступила в контакт с другой аналогичной клеткой.

99 Отсутствие сигнала от ростового фактора Потеря связи с опорным субстратом Вступление делящихся клеток в контакт друг с другом Рецепторы к данному фактору переходят в невозбужденное состояние и перестают активировать (через белки GRB и SOS) белок RAS Интегрины переходят в невозбужденное состояние и перестают активировать (через тирозинкиназы Fak и Src) белок SHC Кадгерины изменяют конформацию и связывают белок β-катенин Инактивация каскадов МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ) Инактивация ПМКТФ (премитотического комплекса транскрипционных факторов) Увеличение содержания и /или активности белка р53 Включение гена белка ARF или выключение гена белка Mdm2

100 Апоптоз при недостатке митогенных сигналов 1) Первая стадия апоптоза заключается в том, что изменяется состояние расположенных в плазмолемме а) рецепторов ростового фактора, б) интегринов или в) кадгеринов. Это сказывается на состоянии адаптерных белков (взаимодействующих с цитоплазматическими доменами вышеназванных белков).

101 Апоптоз при недостатке митогенных сигналов Вторая стадия процесса передача сигнала на белок р53. Механизм передачи сигнала: а) из-за отсутствия сигнала от рецептора или от интегринов инактивируются каскады МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ); б) по этой причине либо из-за связывания кадгеринами ß-катенина не может собраться премитотический комплекс транскрипционных факторов,

102 Апоптоз при недостатке митогенных сигналов в)среди многочисленных последствий нефункционирования этого комплекса изменение активности гена одного из белков (ARF или Mdm-2), контролирующих активность и (или) распад белка р53. В результате активность и (или) содержание данного белка возрастают. После этого ход апоптоза, вероятно, уже не отличается принципиально от предыдущей схемы.

103 Апоптоз, вызываемый фактором некроза опухоли А. Связывание ФНО α со своим рецептором приводит к тому, что с цитоплазматическими «доменами смерти» последнего поочередно взаимодействуют адаптерные белки: TRADD, FADD и RIP. Это ведет к активации каспазы 8, а с ней и всего каспазного каскада. В данном варианте апоптоза не участвует белок р53 и клетка очень быстро переходит к стадии 4.

104 Апоптоз, вызываемый ФНО Б. второй, более длинный, путь начинается с активации мембранных ферментов (сфингомиелиназы и церамидазы), которые разрушают сфингомиелин мембраны до свободного сфингозина. У сфингозина много эффектов: активация казеинкиназы, в свою очередь, активирующей белок р53; активация протеинфосфатаз, дефосфорилирующих и ферменты МАПК; инактивация протеинкиназы С, способной запускать каскады МАПК. Но выключение этих каскадов ведет к накоплению и (или) активации белка р53, что еще более усиливает действие казеинкиназы со стадии 3 апоптоз идет так же, как изложено выше

105 Действие ФНОα на мембранный рецептор (R1- ФНОα) С «доменами смерти» рецептора последо- вательно связы- ваются адаптерные белки TRADD, FADD и RIP Активация каспазного каскада (через каспазу 8) Накопление сфингозинаУвеличение цАМФ Активация казеинкиназы Инактивация каскада МАПК Активация ПК-А Увеличение содержания и активности белка р53 Активация транскрипционного фактораNF-kB Открытие каналов в мембранах митохондрий Накопление NO Накопление белков закрывающих каналы митохондрий Накопление ингибиторов каспаз Повреждение мембраны и увеличение проницаемости Активация митохондриальными факторами (протеазой AIFи цитохромом с) каспазы 9 и всего каспазного каскада A Б через сфингомиелазу и церамидазу В Через G 2 белок и аденилатциклазу через ПК-С и ПФ - - Антиапоптозное действие

106 Апоптоз, вызываемый ФНО В. Имеется третья ветвь, благодаря которой реакция клетки на ФНО α оказывается не столь однозначной. В клетке повышается концентрация цАМФ, и активность протеинкиназы А (ПК-А). ПК-А, в отличие от ПК-С, инактивирует каскады МАПК ПК-А может активировать и транскрипционный фактор NF-kB с широким спектром действия. а) стимуляция гена индуцибельной NO-синтазы. Накапливающийся оксид азота усиливает повреждения мембран. б) С другой же стороны, фактор NF-kB, оказывает и противоапоптозное действие: активирует гены ингибиторов каспаз (AIP) и ген белка A1/Bf11, закрывающего митохондриальные каналы.

107 Апоптоз В итоге, можно сделать два следующих вывода: а)схемы апоптоза различаются своими начальными стадиями. б) в регуляторном обеспечении апоптоза (а возможно, и других процессов) не все так уж однозначно «подогнано» под требуемый результат: имеются и определенные «несовершенства».

108

109 Роль апоптоза в созревании и функционировании иммунной системы Подверженность клеток апоптозу Хотя апоптоз клеток, как мы видели, часто встречается в очень многих органах и тканях, все же его роль в созревании и функционировании иммунной системы особенно велика; Эта роль апоптоза лучше всего изучена.

110 Роль апоптоза в созревании и функционировании иммунной системы В длительном процессе созревания Т- и В- лимфоцитов подверженность клеток апоптозу неоднократно меняется то значительно повышается, то вновь снижается. Действительно, чтобы подвергнуться апоптозу, индуцированному, например, фактором некроза опухолей, клетка должна нести на поверхности рецептор R1-ФHO α. Имеются в виду вовсе не рецепторы, а митохондриальные белки Всl-2 и Bcl-х. Последние рассматриваются как эндогенные ингибиторы апоптоза.

111 Роль апоптоза в созревании и функционировании иммунной системы При увеличении содержания данных белков устойчивость клеток к апоптогенным факторам возрастает, При снижении содержания устойчивость убывает. При увеличении активности генов в цитозоле создается избыток белков Всl-2 и Bcl-х (сверх того количества, которое требуется для закрытия каналов). И этот избыток «оттягивает» на себя вышеперечисленные апоптогенные белки (Вах, Bad и др.). Состояние митохондриальных каналов регулируется белком р53, а также целым рядом других факторов.

112 Дифференцировка лимфоцитов Сведения о дифференцировке лимфоцитов Как известно, все кроветворные клетки по степени зрелости подразделяются на 6 классов: I)стволовые кроветворные клетки, II) полустволовые клетки, III) унипотентные клетки, IV) бласты, V) созревающие клетки, VI) зрелые клетки.

113 Дифференцировка лимфоцитов Cозревание разбивается на 2 этапа: а) Антигеннезависимый этап включает первичное образование из стволовых клеток крови покоящихся клеток VI класса В- и Т-лимфоцитов. Он происходит в центральных органах кроветворения красном костном мозгу и (в случае Т- клеток) - в тимусе. Таким образом, клетки Т- лимфопоэтического ряда на одной из ранних стадий развития перемещаются из красного костного мозга в тимус, где завершают свою дифференцировку. Это унипотентные предшественники Т-клеток (клетки III класса).

114 Дифференцировка лимфоцитов б)Второй этап (антигензависимый) начинается после иммуноспецифического взаимодействия лимфоцитов с соответствующим антигеном (антигенной детерминантой), т. е. входит как составная часть в клеточную или гуморальную иммунную реакцию. Место его осуществления периферические лимфоидные органы: лимфоидная система слизистых оболочек, лимфоузлы, белая пульпа селезенки. При этом стимулированные клетки из VI класса вновь возвращаются в IV класс бластов (интенсивно делящихся клеток), а затем подвергаются дополнительному созреванию.

115 Дифференцировка лимфоцитов В результате образуются: из стимулированных В-лимфоцитов В-клетки памяти и плазмоциты, интенсивно синтезирующие иммуноглобулины; а из стимулированных Т-клеток Т-клетки памяти и активированные Т-хелперы или Т-киллеры. Рассмотрим некоторые ключевые события лимфопоэза в контексте их связи с апоптозом созревающих клеток. В случае антигеннезависимого этапа дифференцировки имеющиеся сведения более определенны в отношении Т-клеток, а в случае антигензависимого этапа в отношении В-клеток.

116 Антигеннезависимая дифференцировка Антигенне зависимая дифференцировка: ранние стадии 1,а-б) На ранних стадиях созревания выживание и дальнейшее деление Т- лимфопоэтических клеток зависит от присутствия специфических индукторов. Вначале в красном костном мозгу служит Т-лимфопоэтин. Несколько позднее становится абсолютно необходимым присутствие во внеклеточной среде интерлейкина 7 (ИЛ-7). Он же требуется для развития и В-клеток.

117 Антигеннезависимая дифференцировка Причем, если эти рецепторы свободны от связи с индуктором, развивается «апоптоз по команде». Связывание же индуктора не только предупреждает апоптоз, но и через неизвестные еще регуляторные цепочки стимулирует определенные изменения клеточной биохимии и морфологии такие, которые продвигают клетку по пути дифференцировки. Поэтому клетки стоят перед жесткой альтернативой: - или развиваться в направлении, указанном индуктором, -или погибнуть в ходе апоптоза.

118 Антигеннезависимая дифференцировка Однажды вступив в дифференцировку, остановиться на полпути они уже «не имеют права». Это общий закон для всех видов дифференцировки. Во всяком случае, в сперматогенезе действует тот же принцип. Биологический же смысл этого принципа, очевидно, состоит в том, что благодаря ему в организме не сохраняются «беспризорные» и бесполезные клетки, т. е. клетки с неопределенной «жизненной программой». Такая «привилегия» предоставляется лишь стволовым клеткам. 2) При нормальном лимфопоэзе на одной из стадий в клетках происходит уникальное событие перестройка той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов (в случае В-клеток) или Т-клеточных рецепторов (TCR, в случае Т-клеток).

119 Антигеннезависимая дифференцировка Зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 7 ), различающихся по антигенной специфичности своих Ig-подобных рецепторов Если представить, что каждый такой рецептор изначально кодируется двумя отдельными генами (для тяжелой и для легкой цепей), то общий объем всех этих генов (выраженный в нуклеотидных парах ДНК) в 10 раз превысил бы действительный; объем всего генома человека.

120 Антигеннезависимая дифференцировка Как же решается проблема кодирования иммуноглобулинов? По наследству передаются всего несколько сотен генов, отвечающих за структуру Ig. Но они кодируют определенный фрагмент. Существует: 350 генов вариабельных доменов (V'L) легких цепей Ig, 250 генов вариабельных доменов (V'H) тяжелых цепей, 5 генов соединительных участков (JL) легких цепей, 5 генов соединительных участков (JH) тяжелых цепей, 2 гена (CLλ и CLא) константного участка легких цепей 5 генов (Снμ, Сн, Сн α, Сн δ, СН ε ) константного участка тяжелых цепей.

121 Антигеннезависимая дифференцировка В процессе же вышеупомянутой перестройки генома в созревающих иммунокомпетентных клетках происходит перенос, (транспозиция) некоторых из вышеперечисленных генов. Это приводит к тому, что: - в Т-клетках образуется один полный ген, кодирующий TCR (Т-клеточный рецептор), - а в В-клетках два полных гена, для тяжелой и для легкой цепей Ig-подобного рецептора:

122 Антигеннезависимая дифференцировка Поэтому важнейший результат транспозиции генов образование большого числа клонов лимфоцитов с различной иммуноспецифичностью (которая определяется их рецепторными Ig- подобными белками). Итоговый результат определяется множеством случайных комбинаций различных фрагментов Ig. Рецепторы Т-клеток (TCR) включают цепь лишь одного вида. всего нес­колько тысяч клонов.

123 Антигеннезависимая дифференцировка Транспозиция генов-«полуфабрикатов» приводит к подразделению В- и Т- лимфопоэтических клеток на клоны с разной иммуноспецифичностью. Четко не определена стадия лимфопоэза, на которой все это происходит. Равно как ее положение в онтогенезе и конкретное место осуществления.

124 Антигеннезависимая дифференцировка В каких-то клетках сложные процессы перестройки генома могут привести к тем или иным нарушениям структуры ДНК. Должны, видимо, существовать специальные механизмы контроля за результатом транспозиции. Следовательно, эти две причины: а)повышение вероятности повреждений структуры ДНК и б)усиление контроля, будут увеличивать частоту «апоптоза изнутри» на данном критическом этапе лимфопоэза. В конце его на поверхности будущих Т-клеток появляются рецепторный комплекс TCR-CD3, а также маркерные белки CD4 и CD8.

125 Селекция Т-клеток Антигеннезависимая дифференцировка: селекция Т- клеток Продолжаем описание событий, кратко суммированных в табл Если на вышерассмотренном этапе апоптоз служил для отбраковки «плохих», «испорченных» клеток (не сумевших правильно перестроить геном), то затем начинается тщательная селекция клеток по природе их поверхностных (и только что названных) белков. При этом вновь значительно возрастает роль «апоптоза по команде» для элиминации отбракованных клеток. Селекция проходит в несколько стадий.

126 Селекция Т-клеток 3. Положительная селекция. В основе функций зрелых Т-клеток лежит способность реагировать со специальными поверхностными белками других клеток: антигенами ГКГ-I, имеющимися практически у всех клеток, и антигенами ГКГ-II содержащимися лишь у анти- генпредставляющих клеток В-лимфоцитов, макрофагов (включая их многие разновидности) и некоторых специализированных эпителиоцитов. а) Поэтому первый этап селекции устранение тех пре-Т-клеток, рецепторы которых (TCR) не способны взаимодействовать с существующими в организме ГКГ того или иного класса.

127 Селекция Т-клеток Процесс проходит в глубоких слоях коры тимуса. И в качестве «экзаменаторов» выступают ретикулоэпителиальные клетки, образующие строму лимфоидной ткани тимуса. Они одновременно содержат на своей поверхности: и весь набор антигенов ГКГ-I (как и прочие клетки организма), и, видимо, весь набор антигенов ГКГ-II (на правах специализированных эпителиальных клеток). Принцип селекции отражается следующей простой схемой: Пре-Т-клетка Ретикулоэпителиоцит TCR (+CD3, CD8) - ГКГ-I илиTCR (+CD3, CD4 - ГКГ-II Или Fas-рецептор - Fas-лиганд

128 Селекция Т-клеток Если TCR пре-Т-клетки не взаимодействует с каким- либо антигеном ГКГ ретикулоэпителиоцита, то начинают взаимодействовать Fas-рецептор) и Fas- лиганд. Возбуждение Fas-рецептора на поверхности клетки ведет к запуску в этой клетке «апоптоза по команде». Таким образом, на данном этапе отбраковывается и погибает весьма большое количество пре-Т-клеток, чьи TCR могли бы узнать какие-то другие белки, но не белки ГКГ-I или ГКГ-II Сохраняются же пре-Т-клетки, способные к «контрольному» узнаванию. Поэтому данный отбор обозначается как положительная селекция. (

129 Селекция Т-клеток б)Вначале у всех пре-Т-клеток на поверхности появляются оба белка, по которым различают Т-киллеров и Т- хелперов, и CD4, и CD8. Позднее же (после вышеописанного этапа положительной селекции или одновременно с ним) у одних клеток (будущих Т-киллеров) остается только белок CD8, у других (будущих Т-хелперов) только CD4.

130 Селекция Т-клеток в)Такая дифференциация приводит к выбраковке и гибели еще примерно половины оставшихся клеток. Действительно, теперь должны быть удалены из популяции клетки с «неправильным» взаимодействием: Т-киллеры (СD8+-клетки), чьи TCR узнают какой-либо антиген ГКГ из класса II, Т-хелперы (СD4+клетки), реагирующие на антиген ГКГ-I. Но никаких дополнительных механизмов для такой выбраковки не требуется. Для того, чтобы взаимодействие TCR с антигеном ГКГ было достаточно сильным, в нем должен участвовать белок CD4 (при контакте с антигеном ГКГ-П) или белок CD8 (при контакте с антигеном ГКГ-1).

131 Селекция Т-клеток 4. Отрицательная селекция. После вышеописанных событий в клетках активизируются синтетические процессы, в результате чего на поверхности возрастает количество молекул TCR и связанных с ними молекул белков CD. Наступает очередь т. н. отрицательной селекции. Теперь элиминации подвергаются Т-клетки, способные к специфическому узнаванию антигенных детерминант в составе белков ГКГ. А в роли «экзаменаторов» выступают дендритные клетки одна из разновидностей макрофагов. Таким образом,если при положительной селекции, из-за невысокого со­ держания TCR, распознавался лишь некий общий образ белков ГКГ и способные к такому распознаванию клетки сохранялись, то при отрицательной селекции (когда плотность расположения TCR значительно увеличена) речь идет о детекции конкретных антигенных детерминант в ГКГ, и клетки, узнающие эти детерминанты, уничтожаются.

132 Селекция Т-клеток Смысл процесса очевиден удаление аутореактивных клонов Т-клеток.. А. Была выдвинута гипотеза о том, что Т-киллеры узнают не всевозможные чужеродные антигены ГКГ-1, а собственные белки ГКГ-1. И активируются тогда, когда не могут найти на «обследуемой» клетке «свой» неизмененный белок ГКГ-1. Если это действительно так, то для популяции Т- киллеров отрицательная селекция не требуется. И весь необходимый отбор ограничен лишь положительной селекцией клеток, узнающих собственные антигены ГКГ-1.

133 Селекция Т-клеток Б. Отрицательная селекция лимфоцитов отнесится лишь к Т-хелперам. Однако и в этом случае непонятно, откуда берутся на поверхности дендритных клеток (в связанном состоянии с белками ГКГ-II) антигенные детерминанты всевозможных собственных белков организма. Т. е. белков, находящихся в норме в составе самых различных клеток.

134 Селекция Т-клеток Что касается В-лимфоцитов, то у них положительная селекция не проходит совсем (т. к. им не требуется узнавать какие-то собственные белки типа антигенов ГКГ). И все дело ограничивается отрицательной селекцией (удалением аутореактивных клонов), которая в данном случае безусловно необходима.

135 Селекция Т-клеток 5. По окончании же процессов селекции «рецептор смерти» (Fas-R) исчезает с поверхности лимфоцитов. Кроме того, по некоторым данным, усиливается экспрессия генов BCL-2 и BCL-X. В результате устойчивость к апоптозу повышается, и клетки переходят в покоящееся состояние.

136 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Первичное взаимодействие В-клетки с чужеродным антигеном и последующую ее активацию Т-хелпером опустим: здесь об апоптозе говорить не приходится. Зато далее начинаются события, в которых апоптоз является важной «сюжетной линией».

137 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Речь идет о процессах, протекающих в лимфатических узелках периферической лимфоидной системы после антигенной стимуляции одного или нескольких клонов В-клеток Причем, появившиеся недавно представления весьма существенно корректируют устоявшиеся взгляды и о самих этих процессах, и о клеточной организации лимфатических фолликулов.

138 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Две области: светлый реактивный (или герминативный) центр с делящимися В-иммунобластами и окружающую этот центр темную корону (мантию) с В- клетками памяти и проплазмоцитами.

139 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Современная трактовка сохраняет это деление, но I) «забирает» у короны часть темной области, относя ее к реактивному центру; II) различает в этом центре несколько зон и III) указывает два принципиально новых процесса, происходящих в соответствующих зонах. а) После стимуляции антигеном и Т-хелпером В-клетки мигрируют в т. н. темную зону реактивного центра, где в них резко интенсифицируется мутагенез. Клетки на этой стадии называются центробластами.

140 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Механизм мутагенеза развивается по двум направлениям: 1.усиление продукции клеткой мутагенных факторов (например, того же оксида азота) и 2.ослабление деятельности определенных защитных систем (системы репарации ДНК, антиоксидантной системы и т. д.). Биологический смысл мутагенеза в В-клетках образование, наряду с прочими «мутантами», и таких клеток, чьи Ig-подобные рецепторы имели бы большее сродство к попавшему в организм антигену. В каких-то клетках мутагенез приводит к значительным повреждениям ДНК, влекущим «апоптоз по команде».

141 Антигензависимая дифференцировка В-клеток б) Кроме того, необходимо провести селекцию мутировавших клеток по сродству их рецепторов к антигену. Это осуществляется в светлой базальной зоне реактивного центра, а подвергаемые селекции В-клетки называются центроцитами. Процесс проходит по принципу положительной селекции. Вновь можно составить несложную схему: Центроцит Дендритная клетка Ig-noд. рецептор - АД-ГКГ-II CD40 - CD154 (CD40L) или Fas-рецептор - Fas-лиганд

142 Антигензависимая дифференцировка В-клеток Она означает, что антигенные детерминанты (АД) попавшего в организм антигена фиксированы на поверхности дендритных клеток вышеуказанной зоны фолликулов и, скорее всего, как обычно, связаны с белками ГКГ-II «Удачное» взаимодействие между инспектируемым Ig- peцептором и АД скрепляется неспецифическим взаимодействием двух белков из группы CD. На поверхности контактирующих клеток наготове находится и пара Fas-рецептор (у В-клетки) Fas- лиганд (у дендритной клетки). И если исследуемое сродство невысоко, то взаимодействие этой пары запускает «апоптоз по команде» в центроците (В- клетке).

143 Антигензависимая дифференцировка В-клеток За) По окончании селекции отобранные клетки перемещаются в самую светлую зону реактивного центра т. н. апикальную светлую и только теперь становятся классическими В-иммунобластами. Они интенсивно делятся. Fas-рецепторы с поверхности исчезают: необходимости в них более нет. Так что команды на апоптоз уже не поступают и не воспринимаются. С другой стороны, как мы знаем, интенсивные митотические деления повышают вероятность «апоптоза изнутри».

144 Антигензависимая дифференцировка В-клеток б) Наконец, клетки выходят из клеточного цикла и в короне узелка дифференцируются либо в В-клетки памяти, либо в проплазмоциты. В лимфоузлах, плазматические клетки накапливаются в мозговых тяжах. И активно продуцируют IgM. В ходе антигензависимой дифференцировки В-клеток происходит, помимо мутагенеза, еще один затрагивающий геном процесс амплификация (многократное увеличение числа копий) генов IgM.

145 С-переключение Через некоторое же время после начала синтеза и продукции Ig их класс меняется: с IgM на один из остальных четырех классов. Этот феномен и обозначается как Сн- переключение переход от образования Ig с одной С-областью к синтезу Ig с другой одноименной областью.

146 С-переключение Механизм данного перехода опять состоит в транспозиции генов. А именно: в полном гене Н-цепи вырезается участок C, оставшаяся часть этого гена (SV"H-JH) сшивается с од­ ним из остальных Сн- генов Сн7, Сна, Сне или Сн8.

147 С-переключение Там же, где происходит реорганизация генетического материала, всегда возможны ошибки и повреждения. Т. е. часть клеток будет подвергаться «апоптозу изнутри». 5. После Сн-переключения на некоторое время наступает стабилизация клеток- плазмоцитов и В-клеток памяти. Но со временем медленно нарастает подверженность клеток апоптозу (вероятно, опять «апоптозу изнутри»). И без новой стимуляции клона В-клеток тем же антигеном численность его (клона) значительно сокращается.