Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает. - презентация

1

2 Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский

3 1.Методы молекулярно­цитогенетического анализа и диагностика хромосомных патологий. –Цитогенетические методы исследования кариотипа человека. –FISH. 2.Методы, используемые для идентификации известных мутаций. 3.Новые методы обнаружения мутаций и генетических полиморфизмов

4

5 Стратегия эксперимента Метод исследования выбирается в зависимости от поставленной задачи и типа материала Основные этапы : 1.Выделение материала 2.Культивирование 3.Фиксация 4.Окраска 5.Оценка кариотипа: Числовая Структурная характеристика Использование методов стандартной окраски позволяет произвести 1.Оценку количества хромосом 2.Количество хромосом внутри группы 3.Определение хромосомных и хроматидных разрывов, межхромосомных обменов Используется для диагностики синдромов ломкости хромосом.

6 Стандартная окраска Диагностическими характеристиками при определении ломкости хромосом на цитогенетическом уровне являются: 1. частота и спектр спонтанных хромосомных аберраций, 2. частота и спектр индуцированных in vitro хромосомных аберраций. При цитогенетическом анализе проводится учет следующих показателей (%): - суммарная частота всех хромосомных аберраций, - частота хромосомных аберраций хроматидного типа (хроматидная делеция, внутрихромосомный внутриплечевой или межплечевой обмен, межхромосомный хроматидо-хроматидный обмен) - частота хромосомных аберраций хромосомного типа (хромосомная делеция, ацентрический свободный парный фрагмент, ацентрическое кольцо, перицентрическая инверсия, кольцевая хромосома, реципрокная транслокация, дицентрическая хромосома). - ацентрический свободный парный фрагмент(1) - одиночный разрыв (2) - изохроматидный пробел (3)

7 Стандартная окраска -межхромосомные хроматидо-хроматидные обмены между негомологичными хромосомами

8 Дифференциальное окрашивание (G-окрашивание) Основной метод использующийся для определения кариотипа клеток Позволяет наиболее полно оценить крупные изменения кариотипа

9 Дифференциальное окрашивание (G-окрашивание) Гиперплоидия (47-50 хр.): 48,XX,+X,+21. Гиперплоидия (>50 хр.): 58, XX,-X,-1,-2,-3,-5,-9,-11,-12,-13, +14,-15,-16,+18,-19,-20,+21, ,XY,t(11;19)(q23;p13) 46,XY,t(4;11)(p22;q23)

10 Дифференциальное окрашивание (G-окрашивание) 57,XY,t(1;22)(p13;q13),del(1)(p13),del(1)(q23),+2,+5,+6,+7,+10,+15,+19,+21,+21,+21,+22

11 Диагностика хромосомных патологий. Принцип флуоресцентной микроскопии Хромосомные аномалии - одна из распространенных причин наследственных заболеваний и врожденных патологий человека. С реорганизацией хромосом часто связана злокачественная трансформация клеток, ведущая к развитию онкологических заболеваний. Для решения многих проблем цитогенетической диагностики оказалось недостаточно использования только классических методов хромосомного анализа, базирующихся на дифференциальном окрашивании хромосомных районов. За пределами возможностей этих методов остаются: идентификация материала малых сверхчисленных маркерных хромосом, дупликации, делеции, инсерции небольших районов, несбалансированные транслокации. Сравнение эффективности хромосомного анализа, проведенного методом 24-цветной флуоресцентной гибридизации iп situ (FISH), и методом GTG­ дифференциальной окраски хромосом наглядно демонстрирует необходимость широкого внедрения в практическую диагностику современных молекулярно-цитогенетических методов исследования.

12 Диагностика хромосомных патологий. Принцип флуоресцентной микроскопии Диагностика хромосомных патологий. Принцип флуоресцентной микроскопии. Показано, что в случае гематологических заболеваний методами дифференциального окрашивания хромосом выявлялось и правильно идентифицировалось только 30% хромосомных перестроек, обнаруженных с помощью 24-цветной FISH. Еще около трети перестроек идентифицировалось неверно, а треть - оставалась совсем незамеченной. Еще хуже дело обстояло с анализом хромосомных перестроек в клетках солидных опухолей: методы дифференциального ок­ашивания хромосом позволяют выявить и правильно идентифицировать лишь 15% хромосомных перестроек, описанных с помощью 24-цветной FISH [Schroeck et al., 2000]; Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аномалий значительно повысили разрешающую способность диагностики хромосомных патологий и её надежность. Они сделали возможным проведение исследований при полном отсутствии митотических клеток, что позволило в ряде случаев полностью пересмотреть принципы проведения хромосомного анализа.

13 Наследственные и врожденные хромосомные патологии Большинство численных и структурных аномалий хромосом проявляется в виде разнообразных нарушений развития организма. Исключением является часть инверсий хромосомных районов и сбалансированных транслокаций. Анеуплоидии хромосом обычно либо несовместимы с жизнью, либо приводят к множественным порокам развития. Существует лишь небольшой список трисомий и моносомий, совместимых с рождением жизнеспособного потомства. Наименее серьезные нарушения развития вызывает анеуплоидия половых хромосом (45,Х; 47,ХУУ; 47,ХХХ; 47,ХХУ). Известны примеры трисомии аутосом: 13-й (синдром Патау), 18-й (синдром Эдвардса) и 21-й (синдром Дауна). Зарегистрированы единичные случаи родов с трисомией хромосом 8, 9 и 22. Эти хромосомные патологии сопровождаются множественными пороками развития, резким снижением жизнеспособности и ранней постнатальной смертностью. Трисомии других аутосом являются причиной гибели плода уже на ранних стадиях эмбрионального развития. Частичные (по отдельным районам хромосом) трисомии и моносомии наблюдали в 4% обследованных беременностей. Обычно они являются следствием несбалансированных транслокаций, инсерций, делеций и дупликаций небольших хромосомных районов, формирования малых сверхчисленных хромосом. К сожалению, этот перечень полностью совпадает с списком хромосомных перестроек, диагностика которых серьезно затруднена в случае использования только «классических» методов хромосомного анализа.

14 Наследственные и врожденные хромосомные патологии Некоторые хромосомные аномалии могут сохраняться в нескольких поколениях и не вызывать серьезных аномалий развития, в то время как другие приводят к формированию ярко выраженных клинических синдромов. Синдром тетрасомии 18р обычно связан с наличием сверхчисленной хромосомы i(l8)(pl0). Синдром Паллистера-Киллиана обусловлен присутствием в части клеток изохромосомы i(J2)(р1О). Синдром «кошачьего глаза» является результатом трисомии или тетрасомии района 22pter~qll. Для формирования синдрома Дауна не обязательна трисомия всей хромосомы 21. Вполне достаточно трисомии района 2Jq22. Большое значение для развития того или иного синдрома имеет положение точек разрыва, которые происходят при хромосомной перестройке. Нередко их минимальное смещение приводит к принципиально иным последствиям. Например, у пациентов с делецией части района 3pter~p25 наблюдается целый спектр различных аномалий развития: от нормального варианта до задержки физического развития, умственной отсталости, микроцефалии, нарушений развития сердечно- сосудистой системы и др. Показано, что при сохранении на аномальной хромосоме 3 близко расположенных локусов D3SJ585 и D3SJ263 (район 3р25) делеция приводит лишь к несущественным отклонениям от нормального фенотипа. При делеции, затрагивающей только дистальный локус, развиваются значительно более серьезные нарушения, включающие поражение сердечно­сосудистой системы, задержку умственного развития и ряд других аномалий. Таким образом, точное описание хромосомной анома­лии нередко оказывается решающим фактором при постановке диагноза, опре­делении прогноза и принятии решения о прерывании беременности.

15 Цитогенетический анализ при онкологических заболеваниях Анализ процесса малигнизации клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии показал, что они тесно связаны с реорганизацией генома, которая нередко проявляется в виде структурных или численных изменений хромосом и их отдельных районов. В настоящее время известны множественные примеры хромосомных перестроек, которые либо обуславливают предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, либо могут являться прямой причиной злокачественной трансформации. Опухолевая прогрессия часто связана с появлением клеточных клонов, несущих новые хромосомные перестройки и отличающихся от исходного штамма рядом признаков, имеющих непосредственное значение для прогнозирования развития заболевания и выбора оптимальной стратегии лечения. Результаты анализа неоплазий, несущих различные хромосомные аномалии, были суммированы и опубликованы в пятом издании «Каталога хромосомных аберраций при онкологических заболеваниях» (Mite1mal1 et al., 1997). Выявлены новые гены, изменение экспрессии которых в ряде случаев приводит к малигнизации клеток. Стала очевидной клиническая значимость данных хромосомного анализа. Хромосомы малигнизированных клеток печально известны своей «плохой, морфологией, крайне затрудняющей проведение «классического» цитогенетического анализа. После проведения курса химио- или радиотерапии крайне проблематичным становится даже получение препаратов метафазных хромосом.

16 Цитогенетический анализ при онкологических заболеваниях Решение было найдено благодаря переходу от изучения морфологии аномальной хромосомы к визуализации районов ДНК, входящих в ее состав. Это определило развитие цитогенетики злокачественных заболеваний в двух направлениях: 1) - создание и развитие новых методов анализа хромосомных перестроек неизвестного происхождения; 2) - создание методов выявления определенной хромосомной перестройки. 06а эти направления имеют большое практическое значение. В настоящее время одним из основных методов идентификации хромосомного района (по входящей в его состав ДНК) является гибридизация нуклеиновых кислот iп situ (FISH). В различных вариантах она является составной частью большинства современных методов молекулярно-цитогенетического анализа. Диапазон получаемых результатов варьирует от определения хромосомной принадлежности районов всех хромосом анализируемой клетки, выявления нарушения баланса хромосомных районов, до детекции транслокаций, сопровождающейся локализацией точек разрывов с точностыо до десятков тысяч пар нуклеотидов.

17 Основные принципы гибридизации нуклеиновых кислот in situ Гибридизация НК iп situ была разработана для локализации фрагментов нуклеиновых кислот в метафазных и профазных хромосомах. Вскоре этот метод нашел широкое применение и в диагностических лабораторияx, связанных с анализом хромосомных патологий. В его основе лежит создание и использование препаратов ДНК, содержащих последовательности нуклеотидов, отвечающие определенным требованиям. В простейшем случае это последовательности, гомологичные участкам ДНК интересующего исследователя хромосомного района. Для их использования при гибридизации iп situ необходимо введение в ДНК элементов, позволяющих выявлять меченую ДНК при микроскопическом анализе, т.е. создание меченой ДНК - «ДНК-пробы». После получения ДНК-пробы можно пристynать к проведению гибридизации ДНК-пробы и ДНК цитологического препарата. В общих чертах, опуская технические пункты протокола, гибридизация iп situ заключается в денатурации ДНК-пробы и цитологического препарата с последующей совместной ренатурацией, обеспечивающей формирование дуплексов меченой ДНК и ДНК препарата. Несвязанная меченая ДНК отмывается, после чего проводится выявление (визуализация на цитологическом препарате) введенных в ДНК-пробу элементов. В первых экспериментах таким элементом был тритий - радиоактивный изотоп водорода. Замена последнего на определенные химические соединения обеспечила более высокий уровень разрешения и открыла путь к одновременному использованию большого числа ДНК-проб, новым методам регистрации и обработки результатов гибридизации iп situ. Что привело к появлению нового раздела цитогенетики - количественной молекулярной цитогенетики.

18 Принцип метода FISH

19 Основные принципы гибридизации нуклеиновых кислот in situ Сегодня мечение ДНК принято разделять на «прямое» и «непрямое». Прямое меченuе предполагает введение в ДНК репортерных элементов (РЭ), которые могут непосредственно наблюдаться при микроскопии. Это различные флуорохромы, такие как флуоресuеинизотиоцианат (FIТC), родамин, диэтиламинокумарин (DЕАС), аминометилкумарин (АМСА), техасский красный (TexRed), цианиновые красители (Су3, Су3,5, Су5, Су5.5, Су7) и многие другие. При непрямом способе меченuя в качестве РЭ применяют также самые разные соединения (биотин, дигоксигенин, 2,4-динитрофенил), присутствие которых на цитологическом препарате выявляется «не прямо», а опосредованно, с помощью перечисленных выше флуохромов, конъюгированных с молекулами, специфически связывающимися с РЭ. Непрямой вариант мечения ДНК-пробы позволяет добиться уровня сигнала, в несколько раз превышающего сигнал при использовании прямо меченной ДНК- пробы. Это объясняется присутствием трех-четырех молекул флуорохрома на молекуле антитела, специфичного к РЭ. Кроме того, в некоторых системах детекции существует возможность каскадного усиления сигнала. Такое усиление достигается несколькими последовательными обработками препарата. К сожалению, одновременно с интенсивностью сигнала растет уровень фона, что не позволяет проводить бесконечные циклы усиления. Острота проблемы регистрации слабого сигнала значительно уменьшилась благодаря совершенствованию микроскопической техники и способов регистрации флуоресцентного сигнала. Охлаждаемые CCD-камеры позволяют накапливать сигнал в течение десятков минут и надежно регистрировать очень слабую флуоресценцию.

20 Основные принципы гибридизации нуклеиновых кислот in situ Этим обусловлена тенденция все более широкого использования прямо меченных ДНК-проб, но и сегодня при одно- или двухцветной FISH чаще используется непрямое мечение. Для мечения ДНК могут быть использованы самые разные методы: 1)прямое введение РЭ в результате химической модификации ДНК; 2)включение меченных предшественников с использованием ДНК-полимераз 3)для крупных молекул ДНК эффективным является использование ник- трансляции. 4)Если ДНК­проба представляет собой относительно короткий фрагмент, не превышающий 1,5-2,5 kb, фланкированный известными последовательностями, то наиболее рациональным является ПЦР. Необходимо учитывать, что даже в тех случаях, когда ДНК-проба соответствует фрагменту ДНК размером в сотни тысяч или млн. пар нуклеотидов, для гибридизации iп situ она должна быть подготовлена в виде молекул ДНК размером от 0,1 до 1 kb. Для более крупных молекул ДНК-мишень на цитологическом препарате часто оказывается недоступной, либо доступной лишь частично. В ходе ПЦР происходит не только включение РЭ в ДНК, но и увеличение ее количества на несколько порядков. В связи с этим, ПЦР как метод мечения приобретает все большую популярность. Использование в ПЦР вырожденного или частично вырожденного праймера позволяет решить сразу три задачи: ввести в ДНК РЭ, разбить длинную молекулу ДНК на фрагменты размером 0,2-1,5 kb, наработать необходимое количество ДНК-пробы. К сожалению, этот подход может быть реализован только для молекул ДНКдостаточно большого размера.

21 Основные принципы гибридизации нуклеиновых кислот in situ Гибридизация ДНК-проб, гомологичных протяженным районам, имеет ряд особенностей. В составе такой ДНК-пробы находятся последовательности, гомологичные диспергированным повторам. Для подавления их гибридизации с ДНК цитологического препарата перед проведением FISH денатурированная ДНК-проба отжигается с кратным избытком немеченой Cotl ДНК человека (фракuия высокоповторенной ДНК). В результате отжига основная масса меченой повторенной ДНК реассоциирует с Cotl ДНК и таким образом выводится из процесса гибридизации с ДНК хромосом или интерфазных ядер. Этот методический прием позволяет использовать ДНК-пробы, приготовленные на основе хромосомо- и районоспецифичных ДНК- клонотек, огромных фрагментов геномной ДНК, клонированных в дрожжевых (УАС), бактериальных (ВАС) и вирусных (РАС) векторах. Метод FISH с супрессией гибридизации диспергированных повторов получил широкое распространение в диагностике хромосомных патологий и свое собственное название: Chromosomal iп situ suppression hybridization (СISS-гибридизация).

22 FISH (флуоресцентная гибридизация iп situ ) Chromosome enumeration probe (CEP) хромосомные нумераторы Locus specific identifiers probe (LSI) Локус-специфичные ДНК-зонды Whole chromosome painting probe (WCP) Хромосом-спеuифические ДНК-пробы «цельнохромосомные красители»

23 Принцип флуоресцентной микроскопии Запирающий фильтр Дихроическое зеркало Возбуждающий фильтр 100 watt ртутная лампа окуляр или камера

24 Принцип флуоресцентной микроскопии. Построение изображения в тройном фильтре.

25 Принцип флуоресцентной микроскопии Chromosome enumeration probe (CEP) трисомия моносомия? колокализация? Уровень ложноположительных сигналов* моносомия 5% трисомия0,2% * Dewald et al. (2001) Clinical Lab Medicine, Chapter 32.

26 Области использования WCP FISH Предимплантационная диагностика методом FISH

27 Принцип флуоресцентной микроскопии нормальная клетка аберрантная клетка колокализованный сигнал Высокая чувствительность зонда Возможность проведения анализа на интерфазных ядрах Дополнительный контроль - сложность анализа аберрантного клона в несбалансированном состоянии из-за колокализации сигнала Локус-специфичные ДНК-зонды (LSI - locus-specific identifiers)

28 Принцип флуоресцентной микроскопии ff d

29 Принцип флуоресцентной микроскопии Whole chromosome painting probe (WCP) А. Нормальная клетка Б. Аберрантная клетка А.А.Б.Б.

30 Принцип флуоресцентной микроскопии методы стандартной цитогенетики (G-бэндинг) флюоресцентная in-situ гибридизация (FISH) полимеразная цепная реакция Использование зондов WCP при анализе маркерных хромосом (на примере t(10;11)(p12;q23) ) Возможные варианты образования химерного гена на примере t(10;11)(p12;q23) транслокация вставка инверсия + вставка инверсия + транслокация транслокация+ микроинверсия

31 Принцип флуоресцентной микроскопии FISH c использованием ДНК-зондов для окраски хромосом 10 и 11 G- бэндинг FISH c использованием локус-специфического ДНК-зонда на MLL ген Инвертированная вставка

32 Принцип флуоресцентной микроскопии Хромосома 11 3 MLL Хромосома 10 MLLT10 p q Механизм возникновения инвертированной вставки Хромосома 11 MLL (11q23) вставка MLL-MLLT10 11q21 q p p q Хромосомa 10 p q точка разрыва

33 Принцип флуоресцентной микроскопии G- бэндинг FISH c использованием локус-специфического ДНК-зонда на MLL ген FISH c использованием ДНК-зондов для окраски хромосом 10 и 11 Инверсия + транслокация

34 Принцип флуоресцентной микроскопии Хромосома 10 Хромосома 11 MLLТ10 Механизм осуществления инверсии и транслокации Хромосома 11 MLL (11q23) транслокация MLL-MLLT10 MLLT10 p q 11q21 q p p q Хромосомa 10 p q точка разрыва

35 Принцип флуоресцентной микроскопии G- бэндинг FISH c использованием локус-специфического ДНК-зонда на MLL ген FISH c использованием ДНК-зондов для окраски хромосом 10 и 11 Выявление криптической вставки 46, XX ПЦР для выявления MLL-MLLT10

36 Принцип флуоресцентной микроскопии Хромосома 10 Хромосома 11 3 MLL Хромосома 11 MLL (11q23) вставка MLL-MLLT10 MLLT10 p q q p p q Хромосомa 10 p q Механизм реализации криптической вставки точка разрыва

37 Использование многоцветного i-FISH (на примере окрашивания ткани опухоли) 4 зонда RREB1 (6p25) SpectrumRed MYB (6q23) SpectrumGold CEP 6 SpectrumAqua CCND1 (11q13) SpectrumGreen

38 Использование многоцветного i-FISH (на примере окрашивания ткани опухоли) Клетки невуса с полным набором сигналов 2 aqua, 2 gold, 2 red, 2 green

39 Использование многоцветного i-FISH (на примере окрашивания ткани опухоли) кератиноцит клетка меланомы

40 Принцип флуоресцентной микроскопии CISH (Chromogenic in Situ Hybridization) Hybridization of Texas Red and FITC labeled FISH probes Incubation with CISH antibody mix Incubation with Red-followed by Blue Chromogen-substrate solution

41 Принцип флуоресцентной микроскопии Multi-colour FISH (M-FISH) and Spectral Karyotyping (SKY)

42 Принцип флуоресцентной микроскопии M-FISH

43 Принцип флуоресцентной микроскопии Cross-Species Colour Banding (R X -FISH)