Генная инженерия. Инженерия Форез Секвенирование, масс-спектрометрия ПЦР Клонирование и выделение: векторы (плазмиды, лентивирусы; транзиентные, шаттл, - презентация

1 Генная инженерия

2 Инженерия Форез Секвенирование, масс-спектрометрия ПЦР Клонирование и выделение: векторы (плазмиды, лентивирусы; транзиентные, шаттл, YAC-BAC), праймеры, рестриктазы, MCS, ориджины, индуцируемая транскрипция. Примеры скрининга и т.п. pull-down блоттинг, бинарный поиск с ооцитами, Дрожжевая Двугибридная Система нокаут, нокдаун микроэррэй, ДНК-белковые вз., биотин-авидин, вычитательная гибридизация Только о некоторых вещах я успею рассказать…

3 Гель-электрофорез Пусть у вас есть смесь фрагментов ДНК (или белков) разной длины и массы. Как разделить эту смесь и выделить индивидуальные компоненты?

4 Гель-электрофорез

5 Гель предотвращает свободную диффузию образца (в воде то же самое не получится) ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота, значит, в растворе она диссоциирует на отрицательно заряженные ионы кислоты и H + (протоны). Если у вас есть смесь фрагментов ДНК длин 10 и 20, то соответствующие анионы кислоты будут иметь заряд O(10) и O(20), то есть заряд просто пропорционален длине фрагмента (и, соответственно, более-менее пропорционален массе).

6 Гель-электрофорез Если теперь к концам геля приложили электрический потенциал, то ЭДС, действующая на ионы пропорциональна их заряду и, соответсвенно, массе F e =Eq = E km. (k - коэффициент, от длины не зависит). Итак, анионы ДНК устремляются к положительно заряженному электроду – аноду, но на них действует сила сопротивления среды, F m = 6rUh, где r – эффективный радиус частиц (зависит от массы, но не линейно, для сферических частиц – как корень третьей степени, для ДНК – степень от 0.4 до 1), U – скорость движения, h – вязкость среды. В равновесии F e = F m, Ekm = 6m 1/3 Uh, U = Ekm 2/3 /h, то есть частицы большего размера достигают меньшей равновесной скорости и ползут по гелю медленнее (?кто бы объяснил мне, почему из формулы следует обратное – пишите на

7 r = N^(1+klnN) Nucleic Acids Res November; 1(11): 1503–1520. PMCID: PMC343427Copyright noticeCopyright notice DNA sequence analysis: a formula to predict electrophoretic mobilities of oligonucleotides on cellulose acetate* Robert Bambara, Ernest Jay, and Ray Wu

8 Секвенирование

9 Секвенирование ДНК по Максаму – Гилберту ( ) Пусть есть образец ДНК, надо узнать его последовательность. Возьмем раствор, содержащий наш образец (одноцепочечную ДНК в достаточном количестве), дезоксинуклеотиды dNTP (кирпичи, из которых строится ДНК), ДНК-полимеразу (белок-строитель), и праймер к образцу (праймер – это комплементарная «затравка» - кусочек ДНК, комплементарный началу нашего фрагмента, достаточной длины, чтобы с него начался синтез комплементарной цепи): Если позволить полимеразе работать (то есть, держать температуру, в которой ей удобно вести синтез), то в результате мы получим полностью достроенные комплементарные цепи. 53

10 Секвенирование ДНК по Максаму - Гилберту А теперь разобьем всю смесь на 4 пробирки, в которых содержатся в небольшом количестве радиоактивно меченные ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP (в каждой пробирке – что-то одно). У ddNTP нет кислорода на 3-конце, поэтому, если его встроили в молекулу ДНК, такая молекула удлиняться не будет, поскольку к ddNTP ничего присоединиться уже не может – на 3 кислорода нет. dATP ddATP

11 Секвенирование ДНК по Максаму - Гилберту Позволим полимеразе работать в каждой из смесей. Для каждой молекулы образца она будет достраивать комплементарную цепь, пока не встроит ddNTP. Притом в пробирке с ddATP это может случиться только в тех местах, где в образце содержался тимин (комплементарный аденину ddATP). Тогда, если в образце были тимины в положениях 5, 7, 14, 15, то в пробирке с ddATP мы получим фрагменты ДНК комплементарной цепи с такими длинами. Сделаем форез, чтобы различить фрагменты разной длины в каждой пробирке, каждая дорожка фореза – одна пробирка. Поскольку ddNTP был радиоактивно помечен, то, проявив гель на фотопленке, мы увидим только комплементарные цепи с ddNTP.

12 Секвенирование ДНК Сейчас происходит бум в этой области, секвенирование сильно подешевело и ускорилось. За последний год прочитанные геномы людей появляются сотнями. Тут, правда, есть проблема, как их собирать. Обо всем этом будет отдельная лекция.

13 Масс-спектрометрия (секвенирование белков) Есть белок неизвестной последовательности, надо эту последовательность узнать. Белок щепится на короткие пептиды, которые разделяются форезом или высокоэффективной тонкослойной жидкостной хроматографией (HPLC). Эти пептиды секвенируют масс-спектром и смотрят по базе данных BLASTом, что это за белок; часто совпадение уникально. Разрешающая способность такая, что виртуозы чуть ли не одну молекулу могут поймать; а не виртуозы – фемтомоль ( ).

14 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

15 Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR, Kary Mullis,1983) Пусть у вас есть следовые количества ДНК в косточке неандертальца, а вам нужно получить ее в высокой концентрации, чтобы секвенировать. Действующие лица: ваша двуцепочеченая ДНК (образец), праймеры (короткие кусочки по ~ 20 нуклеотидов, комплементарные к 2 участкам вокруг той области, которую вы хотите «поднять»), dNTP (кирпичи для постройки ДНК), програмируемый чайник, термоустойчивая полимераза (Taq).

16

17 ПЦР Когда вы поднимаете температуру, то цепи ДНК друг от друга отлипают, когда опускаете – происходит отжиг (то есть слипаются обратно). При отжиге чаще слипаются не полные цепи, а праймеры с цепями (просто потому, что праймеров в растворе много, а цепей – мало). Полимераза начинает удлинять праймеры и так во всем объеме => удвоение концентрации цепей ДНК на каждом шаге. Дальше с этой ДНК можно делать все, что угодно, например, отсеквенировать.

18 Наработка белка-продукта вашего гена: клонирование и выделение

19 Клонирование и выделение Допустим, вы знаете последовательность гена, кодирующего какой-то человеческий белок, который вы хотите исследовать. Как получить препарат этого белка? Вам нужно как-то встроить ген вашего белка в какой- нибудь организм (обычно, в E.Coli) и заставить его наработать много вашего белка. Затем надо выделить белок из этого организма.

20 Клонирование и выделение Как получить ДНК вашего гена в пробирке? Идете в фирму, занимающуюся хим.синтезом ДНК. Они вам ~за 1000$ («всего 34р. за пару оснований») синтезируют двуцепочеченую ДНК по бумажке с последовательностью вашего гена. Под геном здесь я понимаю только кодирующую последовательность белка, остальное мы добавим отдельно. Кодирующая последовательность5-UTR3-UTR промотортерминатор ATGUGA старт-кодонстоп-кодон

21 Клонирование и выделение Если вам нужно повысить концентрацию вашего гена – ПЦР. Как доставить вашу ДНК в организм для наработки белка? Для этого служат векторы.

22 Векторы Вектор – общее название генно-инженерных конструкций, которые используются для доставки в клетку генетической информации. Самые популярные варианты – плазмиды и вирусы. Плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК бактерий. Они существуют в природе, а на основе имеющихся в природе молекулярные биологи создали для своих нужд искусственные и вы можете купить плазмиду у какой-нибудь фирмы-продавца реактивов для биологов.

23 Клонирование и выделение Итак, вы решили доставлять ваш ген на плазмиде. Как вставить ваш ген в нужное место плазмиды? Надо сделать в нужном месте плазмиды разрез, слепить с ним ген и зашить. Для внесения разрезов служат белки-рестриктазы, которые узнают специфическую для них последовательность ДНК – сайт рестрикции – и вносят в нее разрез.

24 Сайты рестрикции Когда делаете ПЦР своего гена, подбираете праймеры к концам вашего фрагмента так, чтобы на них были сайты узнавания рестриктазы (см. следующие слайды). рестриктазы и реакции, которые они катализируют

25 Праймеры с сайтами рестрикции Нарабатываете ПЦРом любое необходимое количество вашего гена с праймерами, на концах которых есть сайты рестрикции. болтающаяся часть праймера содержит сайт рестрикции отсюда рестриктаза отрежет обведенные кусочки

26 Липкие концы Рестриктазы часто разрезает ДНК, образуя липкие концы, которые позволяют склеивать между собой несколько участков ДНК. Если разрезать сайты на концах праймеров вокруг вашего гена, а также в ДНК плазмиды одной и той же рестриктазой, то можно будет вставить ваш ген в плазмиду – на плазмиде и вокруг гена образуются одинаковые липкие концы, которые имеют шанс слипнуться друг с другом. Разрывы после этого надо «зашить» белком – лигазой. ген плазмида липкие концы (одна цепь длиннее другой)

27 Плазмида pQE 1. Индуцируемый промотор Когда мы внесем плазмиду в клетку, то транскрипция гена, который мы подсадим на эту плазмиду, будет заглушена, потому что в регулируемой части промотора есть сайт посадки клеточного белка-репрессора, который сядет туда и закроет собой промотор. Если добавить определенное вещество, то репрессор отваливается от промотора и транскрипция включается. 2. Сайт посадки рибосомы (RBS) Рибосома хочет садиться на матричную РНК, только если в РНК есть Ribosome Binding Site (что-то в духе AGGAGG) перед старт- кодоном 3. Тэг и полилинкер – СЮДА ВСТАВИТСЯ НАШ ГЕН! Полилинкер (также известен как multiple cloning site, MCS)– это много сайтов рестрикции для разных рестриктаз, налепленных в одном месте создателями плазмиды, чтобы дать нам возможность воспользоваться одним из них, выбрав подходящую рестриктазу. Когда вы будете встраивать интересующий вас ген в плазмиду, вы порежете плазмиду и ваш ген рестриктазой по одному из сайтов рестрикции, получатся липкие концы, по которым плазмида может слипнуться с вашим геном. Тэг – это липучка, дополнительный белковый домен, последовательность которого идет в плазмиде впереди вашего гена и ваш белок будет «спаян» с тегом. Тэг умеет специфически хвататься за некоторые вещества, чем вы воспользуетесь для выделения вашего белка из организма. Например 6xHis-тэг, который присутствует в этой плазмиде, имеет большое сродство к никелю и белок с таким тэгом будет оседать на никелевой колонке. 4. Стоп-кодоны в трех рамках – останавливают трансляцию 5. Терминатор – останавливает транскрипцию 6. Ориджин репликации Благодаря нему в бактериальной клетке плазмида воспроизводится за счет клеточного аппарата репликации. 7. Репортерный ген С помощью него можно понять, в каких бактериях есть плазмида, а в каких – нет. Те клетки, куда плазмида встроится, могут светиться, флуоресцировать или выделывать еще много чего. В данном случае – будет образовывать окрашенный продукт при поедании среды – вы увидите нужные колонии по окраске.

28 Трансфекция Вы разрезали плазмиду и сайты вокруг своего гена по липким концам, часть из них слиплась обратно, часть – образовала вставки гена в плазмиду. Это – то, что вам нужно, вы отбираете фракцию плазмид со встроенным геном из плазмид с невстроенным геном форезом (разница по длине ощутима). Теперь у вас есть плазмида с интересующим вас геном и надо внести ее в бактерию. Есть несколько техник, которые позволяют внести плазмиды в бактерий, например, резко и ненадолго их охладить, а потом погреть. При этом в часть бактерий попадет ваша плазмида.

29 Трансфекция Как отобрать бактерий с плазмидой? Во-первых, надо снять бактерий со среды, развести в воде до очень слабого ратвора, а затем разбрызгать на питательную среду. Тогда через сутки бактерии вырастут на среде пятнами, причем вы можете быть уверены, что каждая колония – это потомки одной клетки (то есть у них всех плазмида или есть, или ее нет).

30 Репортерный ген А если вы добавили в свою среду антибиотик, перед тем как рассевать на нее бактерий? Тогда вырастут только те, у кого есть ген антидота, который есть только на вашей плазмиде. Или вы можете растить их на среде с таким компонентом, что есть его могут только те, у кого есть специальный ген (в данном случае – это ген bla – бета-лактамаза, которая позволяет бактериям есть X-gal – производное галактозы, которое бактерии переваривают до окрашенного голубого продукта) Или можно добавить ген флуоресцентного белка и нужные колонии будут светиться…

31 Выделение продукта Теперь надо наработать, собственно, ваш белок. Кстати, вы можете не включать его наработку до какого-то момента, чтобы не мучить бактерий, которым надо расти и копить силы вашим белком (многие белки токсичны, особенно в больших концентрациях, которых мы и будем добиваться) – это называется индуцируемая экспрессия. Когда вы включили наработку своего белка, бактерии начнут его производить (в огромных количествах, если вам нужно) и белок будет часто образовывать агрегаты внутри клеток. Дальше вы можете убить бактерий, лизировав (разорвав) их клетки, но как выделить ваш белок из того месива, что получилось в итоге с минимальными потерями?

32 Тэг Для этого служат тэги. Это домены, которые пришиты к вашему белку и могут липнуть к чему-нибудь, к примеру, к никелю, как 6xHis или к глутатиону, как GST. Тогда, если прогнать все месиво через никелевую/глутатионовую колонку, то на ней останется только ваш белок. Правда, тэг вам не нужен, поэтому перед ним часто делают сайт для редкощепящей протеазы (тоже белка), которая отрезает этот тэг. Ее вносят, когда ваш белок залип на колонке, а остальное уже смыло. Ваш белок, лишившись тэга по вине протеазы, отщепляется от колонки и уплывает. Но теперь надо избавиться от протеазы. Не беда – сама протеаза тоже может нести тэг и ее можно собрать за него. Все, у вас есть ваш белок, можно ставить над ним опыты.

33 Техники экспериментального определения функции белков (помимо способности просто катализировать химические реакции)

34 Техники определения функций белков Чтобы посмотреть, работа каких генов (говорят, «экспрессия») коррелирует с данным признаком, например, болезнью, проводят association study – в основном, используют чипы – microarray. Чтобы определить с какими белками взаимодействует данный, можно использовать pull-down или дрожжевую двугибридную систему Чтобы посмотреть, к каким последствиям ведет отсутствие/не функционирование данного гена, делают его нокаут или нокдаун

35 Microarray

36 Pull-down

37 Yeast two-hybrid system

38 Gene knock-out

39 Gene knock-down, siRNA Fire, Mello, 1998 Nobel prize, 2006 В основе метода лежит фундаментальнейшее открытие, а сделано буквально вчера ; РНК-интерференция и микроРНК регулируют, по некоторым оценкам, около 90% генов.