Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Макаров П.В., Катаев М.Г., Пак Н.В., Ходжабекян Г.В., Васильев А.В., Терских В.В., Максимов И.Б., Лапина Л.А., Титкова С.М., - презентация

1 Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Макаров П.В., Катаев М.Г., Пак Н.В., Ходжабекян Г.В., Васильев А.В., Терских В.В., Максимов И.Б., Лапина Л.А., Титкова С.М., Иванов А.А. МНИИ ГБ им. Гельмгольца. Институт Биологии Развития им. Кольцова, ММА им. Сеченова, ЦВГ им. Бурденко. МНИИ ГБ им. Гельмгольца. Институт Биологии Развития им. Кольцова, ММА им. Сеченова, ЦВГ им. Бурденко. Клеточная трансплантация и тканевая инженерия в офтальмологии РООФ-2011

2 КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ Клеточная трансплантация Тканевая инженерия -Гемотрансфузия клиника - Транспл. Костного мозга клиника - Эмбриональные эксперименты стволовые клетки - Фетальные эксперименты стволовые клетки - Соматические клиника стволовые клетки -Гемотрансфузия клиника - Транспл. Костного мозга клиника - Эмбриональные эксперименты стволовые клетки - Фетальные эксперименты стволовые клетки - Соматические клиника стволовые клеткиРООФ-2011 (Методики использования)

3 Свойства стволовых клеток (эмбриональные, фетальные, постнатальные, индуцированные СК) Мультипотентность способность к миграции в ответ на повреждение содержат большое количество факторов роста, цитокинов не вызывают иммунной реакции отторжения неограниченно пролиферируют в культуреРООФ-2011

4 Основные направления исследований по применению клеточных технологий в офтальмологии Возрастная макулодистрофия и дегенеративные процессы в сетчатке Регенерация поврежденных тканей глаза (роговица-эндотелий, строма, эпителий; сетчатка) Лимбально-клеточная недостаточность различной этиологииРООФ-2011

5 In 2010, the Food and Drug Administration (FDA) approved a phase I/II clinical trial using human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells for the treatment of dry AMD. These include fetal stem cells, pluripotent stem cells (embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells) and adult stem cells. Induced pluripotent stem cells (iPSC) offer an alternative cellular source for patient- specific treatment without the risk of rejection and ethical problems … donor tissues taken from 16th to 18th week of gestation give the longest in-vitro survival time, and the highest number of cells. After transplantation, these cells were integrated into the recipient retina, and differentiated into rhodopsin positive cells. Methods of delivering stem cells Currently the two most popular methods of delivering stem and progenitor cells into the eye are the intravitreal route and the subretinal route. Promises of stem cell therapy for retinal degenerative diseases Ian Yat-Hin Wong & Ming-Wai Poon & Rosita Tsz-Wai Pang & Qizhou Lian & David Wong Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol (2011) 249:1439–1448 DOI /s zРООФ-2011

6 Stem cells as a therapeutic tool for the blind: biology and future prospects Mandeep S. Singh1,2 and Robert E. MacLaren1,2,3,4* 1Nuffield Laboratory of Ophthalmology, University of Oxford, Oxford OX3 9DU, UK 2Merton College, University of Oxford, Oxford OX1 4JD, UK 3Moorfields Eye Hospital, London EC1V 2PD, UK 4Oxford Eye Hospital, Oxford OX3 9DU, UK *Author for correspondence ( Outer retinal degenerations may in future be amenable to cell replacement. (a) Successful integration of a donor photoreceptor, expressing green fluorescent protein (GFP; green) and labelled with bromodeoxyuridine (BrdU), into a host outer nuclear layer (more...) (more...) Proc Biol Sci October 22; 278(1721):3009– Клеточная трансплантация (сетчатка)РООФ-2011 Figure A suitable cell is obtained from the patient with retinal disease. An easily accessible source of cells is chosen so as to minimize surgical trauma. The example of a skin fibroblast is depicted here.

7 A Microfabricated Scaffold for Retinal Progenitor Cell Grafting William L. Neeley, 1 Stephen Redenti, 2 Henry Klassen, 3 Sarah Tao, 4 Tejal Desai, 4 Michael J. Young, 2 and Robert Langer 1,5* 1 Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts Avenue, Cambridge, Massachusetts, U.S.A. 2 Schepens Eye Research Institute, Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 20 Staniford Street, Boston, Massachusetts, U.S.A. 3 Department of Ophthalmology, School of Medicine, University of California, Irvine, 101 The City Drive, Orange, California, U.S.A. 4 Department of Physiology, University of California, San Francisco, th Street, San Francisco, California, U.S.A. 5 Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts Avenue, Cambridge, Massachusetts, U.S.A. * To whom correspondence should be addressed: Telephone: ; Fax: ; Biomaterials February; 29(4): 418–426. Replacement of photoreceptors using retinal progenitor cells (RPCs) represents a promising therapy for the treatment of retinal degeneration. We report the microfabrication of a poly(glycerol-sebacate) scaffold with superior mechanical properties for the delivery of RPCs to the subretinal space.РООФ-2011

8 Human Corneal Endothelial Cell Proliferation Potential for Use in Regenerative Medicine Nancy C. Joyce, PhD, and Cheng Chris Zhu, MD (Cornea 2004;23(Suppl. 1):S8–S19) Untransformed HCEC can be successfully cultured from the corneas of both young and older donors by using care in the selection of donor material. Care must also be taken in the early phases of endothelial cell isolation to obtain maximal numbers of healthy cells for culture. There appear to be true age-related differences in overall proliferative capacity; however, the relative response to specific growth factors was similar in cells from young and older donors. Results of these studies provide guidelines for successful growth of untransformed HCEC for use in regenerative medicine. Transplantation of Cultured Human Corneal Endothelial Cells Shiro Amano, MD CORNEA Volume 22, Suppl. 1 October 2003РООФ-2011

9 Cultivated Corneal Endothelial Transplantation in a Primate: Possible Future Clinical Application in Corneal Endothelial Regenerative Medicine Noriko Koizumi, MD, PhD,* Yuji Sakamoto, Naoki Okumura, MD, Hideaki Tsuchiya, PhD,§ Ryuzo Torii, DVM, PhD,§ Leanne J. Cooper, PhD, Yuriko Ban, MD, PhD, Hidetoshi Tanioka, and Shigeru Kinoshita, MD, PhD (Cornea 2008;27(Suppl. 1):S48–S55) FIGURE 1. Cultivated monkey corneal endothelial cells (MCECs). A, Primary culture of MCECs (cell density = 2720 cells/mm2). B, Subculture of MCECs on a collagen type I sheet. Alizarin red staining of the cultures revealed mainly hexagonal homogeneous cells with a density of 2800 cells/mm2. Cultivated MCECs on collagen type I sheets expressed ZO-1 (C) and Na+-K+ ATPase (D) on their lateral cell membranes (green). Propidium iodide was used to visualize the cell nuclei (red). Scale bars: 50 mm.РООФ-2011

10 FIGURE 4. Postoperative slit lamp photographs. In cultivated monkey corneal endothelial cell sheet transplanted eyes, the sheet was attached to Descemet membrane on day 3, and a clear cornea was recovered by 2 weeks even though the sheet had become detached and was located in the anterior chamber. These eyes remained clear for #6 months. Two eyes in the transplantation groupwere used for electron microscopy and one underwent longer term observation. Severe corneal edema was observed in the control eyes and resulted in irreversible bullous keratopathy. Some images reprinted from Koizumi et al.18 Copyright 2007, with permission from the Association for Research in Vision and Ophthalmology.РООФ-2011

11 Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. Evangelos Kiskinis and Kevin EgganThe Stowers Medical Institute, Harvard Stem Cell Institute, Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA. The Journal of Clinical Investigation Volume 120 Number 1 January 2010РООФ-2011 Figure 2 Generation of iPS cells. The choice of the cell type from which to derive iPS cells, the choice of reprogramming factors and methods of delivery, as well as evaluation of iPS cell progeny, will depend on the potential application of the resulting cell types.

12 Основные направления экспериментальных исследований по клеточным технологиям в отделе травматологии МНИИ ГБ Фетальные клетки роговицы (эпителиальные, стромальные фибробласты, эндотелиальные) Нейральные стволовые /прогениторные клетки Стволовые клетки эктодермального происхождения Постнатальные стволовые клетки Модели травмы роговицы - кератэктомия, эрозии роговицы, дисбаланс эндотелия Ожог сетчатки, токсическая ретинопатия Лимбально-клеточная недостаточность – ожог роговицы Ожог сетчатки Ишемия сетчаткиРООФ-2011

13 7-е сутки после трансплантации Контроль ОпытРООФ-2011 Субконьюнктивальное введение стволовых клеток эктодермального происхождения 60-е сутки после трансплантации

14 Глазное дно кролика с каинатной ретинопатией на 30 сутки наблюдения Опытный глаз трансплантация НСКОпытный глаз трансплантация НСК Контрольный глазКонтрольный глазРООФ-2011 Источник донорского материала- Ткань мозга эмбрионов I триместра гестации (8-12 недель) Супрахориоидальное введение нейральных стволовых клеток

15 ЭРГ при каинатной ретинопатии Контроль А – до моделирования ретинопатии и трансплантации НСК Б – через 1 сутки, В – через 7 суток, Г – через 1 месяц Опыт: трансплантация НСК РООФ-2011

16 Corneal Reconstruction with Tissue Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium Kohji Nishida, N Engl J Med 2004;351: Copyright © 2004 Massachusetts Medical Society. RECONSTRUCTION OF DAMAGED CORNEAS BY TRANSPLANTATION OF AUTOLOGOUS LIMBAL EPITHELIAL CELLS RAYJUI-F ANG TSAI, M.D., LIEN-MINLI, B.S.,AND JAN-KANCHEN, PH.D. (N Engl J Med 2000;343:86-93.) ©2000, Massachusetts Medical Society. Indian J Ophthalmol 2006,V.54 Восстановление эпителия роговицы аутологичными кератоцитами, выращенными на амниотической оболочке Внешний вид трансплантата Внешний вид трансплантата До операции Через 30 месяцев после операции Тканевая инженерия РООФ-2011

17 Эпителий –клетки эпидермиса человека Эпителий –клетки эпидермиса человека Строма (фибробласты кожи человека в коллагеновом геле «живой эквивалент, роговицы» Строма (фибробласты кожи человека в коллагеновом геле «живой эквивалент, роговицы» Полимерная основа – сетчатый Эндопротез «живой эквивалент кожи» Полимерная основа – сетчатый Эндопротез «живой эквивалент кожи» «живой эквивалент, роговицы, кожи» Трансплантат культивируется в Институте Биологии Развития им Н.К. Кольцова, лаборатория проблем клеточной пролиферации (профессорТерских В.В.) Трансплантат культивируется в Институте Биологии Развития им Н.К. Кольцова, лаборатория проблем клеточной пролиферации (профессорТерских В.В.) Тканевая инженерияРООФ-2011

18 Пациент Б Пациент В Пациент К При поступлении 2-3 трансплантации с интерв. 3-5 дней РезультатРООФ-2011

19 Этапы трансплантации «живого эквивалента кожи» Первая перевязка на 5-е сутки с удалением полимер- ной основы (сетки) Первая перевязка на 5-е сутки с удалением полимер- ной основы (сетки) Перевязочный материал «Jelonet» РООФ-2011

20 Нерешенные вопросы в исследованиях клеточных технологий Отсутствие законодательства и гарантий безопасности применения в клинике Этиологические аспекты применения эмбриональных клеток Биомедицинские аспекты : – как контролировать дифференцировку? – как избежать формирование опухолей? – как долго может сохраняться эффект трансплантации?

21 СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЭПИТЕЛИЯ ЛИМБА, КОНЬЮНКТИВЫ, КОЖИ (АЛЛОГЕННЫЕ, ФЕТАЛЬНЫЕ, ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ, АУТОЛОГИЧНЫЕ) СТВОЛОВЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ (ADAС) КЛЕТКИ ДЕРМАЛЬНОЙ ПАПИЛЛЫ МЫШЕЧНЫЕ КЛЕТКИ НЕЙРАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ МЫШЕЧНЫЕ КЛЕТКИ НЕЙРАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ. Создание принципиально новых живых тканевых эквивалентов роговицы, склеры, конъюнктивы. - Разработка методов выделения и культивирования чистых линий тканеспецифических стволовых клеток -Открытие методов управляемой дифференцировки и пролиферации СК - Обеспечение условий безопасности клеточной трансплантации - Разработка методов выделения и культивирования чистых линий тканеспецифических стволовых клеток -Открытие методов управляемой дифференцировки и пролиферации СК - Обеспечение условий безопасности клеточной трансплантацииРООФ-2011

22 РООФ-2011