Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения. - презентация

1 Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения

2 Содержание 1. Введение 2. История развития моноклональных антител 3. Понятие моноклональных антител 4.Гибридомы: определение и характеристика 5. Основные области применения МКАТ 6. Заключение 7. Список литературы

3 Введени е Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Стандартные препараты антител в иммунных сыворотках получить довольно сложно, так как их состав зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других мало контролируемых факторов. В то же время, для современного анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество из сложных многокомпонентных жидких сред. При проведении иммунохимических исследований, используются антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлем.

4 История Решение проблемы было предложено в 1975 году учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro. Георг Кёлер Цезар Мильштейн

5 Как это было сделано? В 1970-х годах молодой немецкий иммунолог Георг Кёлер изучал генетическую изменчивость антител. Для исследования надо было изолировать клон антителообразующих клеток (АОК) - плазматических клеток (производных от В-лимфоцитов). Необходимо отметить, что В-лимфоциты могут жить только в организме хозяина, и в искусственной питательной среде они быстро гибнут. Их длительное культивирование вне организма невозможно. Наоборот, клетки опухоли из плазматических клеток, называющиеся плазмоцитомами или миеломами, хорошо культивируются и размножаются in vitro и их называют бессмертными».

6 Как это было сделано? Для реализации проекта Кёлер поехал в Англию, в лабораторию Цезаря Мильштейна, изучавшего клоны плазмоцитом, и они вместе разработали оригинальный подход к этой проблеме: решили получить гибрид нормальной АОК и опухолевой клетки. В случае успеха такой гибрид унаследовал бы от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному и бесконтрольному росту. Это им удалось осуществить, создав гибридомную технологию. Разнородные клетки, у которых слились оболочки, образовывали гибриды, которые сохраняли способность к клеточным делениям. Таким образом, возникал истинный гибрид, потомок двух соматических клеток, или гибридома. Кёлер и Мильштейн получили гибридому между нормальной АОК и опухолевой, миеломной клеткой. В системе in vitro слияние соматических клеток может быть индуцировано вирусами, например вирусом Сендай, электрическим воздействием - электрослиянием или химическим веществом - полиэтиленгликолем (ПЭГ). Авторы использовали для слияния ПЕГ

7 Моноклональные антитела антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела (МкАТ) секретируются иммунными клетками, происходящими от единственной антителообразующей клетки. Поэтому МКАТ направлены только против определенного эпитопа иммуногенного вещества, так называемой "антигенной детерминанты"

8 Основные этапы получения гибридомы

9 Гибридомы Гибридома – клетка, получающаяся в результате сплавления В-клетки, продуцирующей антитела, и опухолевой клетки. Такие клетки могут быть клонированы и поддерживаться длительное время в культуре, продуцируя моноклональные антитела. Клетки гибридомы можно также инъецировать мыши, в результате чего образуются асциты, содержащие моноклональные антитела. Методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител ( моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью была описана в 1975 году. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующие антитела одной специфичности. Полученные при слиянии нормальных лимфоцитов, продуцирующих антитела, с подходящей опухолевой линией B-клеток, гибридомы отбирают в культуральной среде, неспособной поддерживать рост родительских клеток. Путем последовательных разведений и пересевов получают одиночные клоны, которые можно выращивать в роллерных культурах или в форме асцита в брюшной полости мышей. В последнем случае удается получать особенно высокие титры моноклональных антител.

10 Основные этапы получения гибридомы

11 Принципиальная схема получения моноклональных антител Мышей интенсивно иммунизировали определенным антигеном - белком, бактериальными клетками или клетками животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку, и из неё готовили взвесь клеток (с большим содержанием В-лимфоцитов). Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки: -- гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и В-лимфоцитов), -- гибриды АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными -- АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся).

12 Принципиальная схема получения моноклональных антител Метаболическая селекция гибридов основана на том, что нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной путь и резервный путь. В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников. При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина (пурины) или из дезокситимидина (пиримидины).

13 Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток Для решения этой задачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипоксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В таких условиях миеломные клетки погибают и остаются функционально активными только гибридомы. В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro, они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции

14

15 Схема получения гибридом (Г. И. Абелев, 1998) А, В, С - многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации (или сложные антигены с множеством антигенных детерминант); АОК - антителообразующие клетки селезенки; Пл - клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ- среде; ПЭГ - полиэтиленгликоль; ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С- антигенам (или антигенным детерминантам)

16 ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ идентификация субпопуляцийй лимфоцитов человека истощение клеточных популяций выделение клеток· установление функций молекул клеточной поверхности определение группы крови· диагностика опухолей и локализация опухолей иммунорадиометрический анализ анализ сложных смесей антигенов анализ эмбрионального развития квадро мы анализ иммунного ответа искусственные ферменты

17 Иммуноанализ o Иммуноанализ это полуколичественный метод определения содержания веществ, присутствующих в очень низких концентрациях. В принципе иммуноанализом можно определять любые соединения, вызывающие образование антител. o Основой этого метода является «реакция» антиген-антитело, т. е. специфическое связывание антитела с определяемым веществом. Из многих разработанных методов иммуноанализа, таких, как радиоммунный анализ (РИА), хемилюминесцентный иммуноанализ и т.д., здесь рассматривается вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

18 ИФА Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител. В основе ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему моноклональным антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена).

19 Радиоиммунотерапия (РИТ) Радиоиммунотерапия (РИТ) - это комбинированный метод лечения, который совмещает в себе возможности радиотерапии и иммунотерапии. При иммунотерапии используются специально созданные в лабораторных условиях моноклональные антитела, обладающие способностью распознавать раковые клетки и связываться с их поверхностью. Моноклональные антитела имитируют активность собственных антител организма пациента, которые в норме атакуют инородные объекты, такие как бактерии и вирусы.

20 Радиоактивные метки При РИТ используются моноклональные антитела, связанные с радиоактивным материалом (так называемой радиоактивной меткой). При введении в кровоток пациента помеченные радиоизотопом моноклональные антитела разыскивают раковые клетки и связываются с ними, что обеспечивает высвобождение высокой дозы излучения непосредственно в опухоли.

21 Применение в онкологии Многочисленные исследования выявили ряд специфических антигенов на поверхностной мембране и в цитоплазме опухолевых клеток, ассоциированных с раком молочной железы человека антигены эпителиальных мембран [СА15–3, СА15–5, СА19–9], муциноподобный ассциированный антиген [МСА], тканевой полипептидный антиген [ТПА], гликопротеидный антиген [ЛСА] и т.д. Динамика уровня других онкомаркеров (онкофетальные антигены РЭА, α-фетопротеин, метаболические маркеры ферритин, микроглобулин; гормонов ХГЧ и АКТГ и ферментов фосфатазы, лактатдегидрогеназы) также позволяет сделать заключение о природе прогрессирования данного онкозаболевания

22 Применение в онкологии На борьбу с онкологическими заболеваниями поставлены новейшие научные достижения компьютерная томография, ультразвуковое сканирование, радиоизотопные методы, но они достигают успеха лишь на достаточно далеко зашедших стадиях этого заболевания. Наиболее ранняя информация может быть получена при определении белков-онкомаркеров, концентрация которых начинает изменяться задолго до того, как опухоль обнаруживается другими методами. Кроме того, постоянное определение концентраций раковых маркеров в организме больных (мониторинг) позволяет оценивать эффективность проводимого лечения, а также обнаруживать рецидивы рака.

23 Моноклональные антитела в лечении онкологических заболеваний В терапии опухолей используют два типа МАТ: простые, или неконъюгированные МАТ, не связанные ни с какими цитотоксическими веществами; конъюгированные МАТ, лечебный эффект которых обусловлен присоединенными к антителу веществами (радиоактивными частицами, цитостатиками или токсинами).

24 Простые моноклональные антитела Большинство эффективно применяемых в онкологии МАТ это простые МАТ. Одни антитела, связываясь с соответствующим антигеном, запускают естест­венные механизмы иммунного ответа организма, которые разрушают опухолевые клетки. Другие МАТ не взаимодей­ ст­вуют собственно с иммунной системой человека - их эффект реализуется через связывание с антигенами, обеспечивающими пролиферацию клеток или рост опухоли.

25 Простые моноклональные антитела Механизм действия антител можно рассмотреть на примере алемтузумаба (Кэмпаса) препарата для терапии хронического лимфолейкоза. Вариабельный регион алемтузумаба соединяется с антигеном CD52 на поверхности лимфоцитов, а константный регион с Fc-рецепторами на поверхности цитотоксических клеток, которые уничтожают мишень (ADCC антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность). Кроме того, Кэмпас активирует систему комплемента, что приводит к образованию комплекса, разрушающего мембрану злокачественной клетки (CDC комплемент-зависимая цитотоксичность). Именно эти два механизма, а также индукция апоптоза считаются основными в действии данных антител.

26 МАТ как носители активных веществ Сегодня терапия опухолей в основном является неспецифической (химиотерапия, лучевая терапия), при которой хоть и достигается некоторый эффект, но при этом значительно повреждаются здоровые клетки организма. Поэтому актуальным сегодня является разработка методов специфической терапии рака, и перспективным в этом направлении является применение моноклональных антител.

27 МАТ как носители активных веществ В последние годы МАТ стали применяться для доставки цитотоксических веществ непосредственно к опухолевым клеткам, что позволяет избежать повреждения здоровых тканей, решает проблему, связанную со слабым противоопухолевым эффектом некоторых антител из-за невозможности проникать глубоко в ткань солидной опухоли. В зависимости от активного вещества, присоединенного к антителу, конъюгированные МАТ подразделяют на следующие группы: с радиоактивными частицами (этот вид терапии также получил название радиоиммунотерапии); с цитостатиками; с токсинами (или иммунотоксинами).

28 МАТ с радиоактивными частицами Ибритумомаб тиуксетан (Зевалин) МАТ против CD20, соединенное с иттрием-90. Сочетанное действие препарата обеспечивает большую эффективность по сравнению с терапией простым антителом к CD20. Зевалин зарегистрирован в 2002 г. для лечения рецидивов и рефрактерных форм фолликулярных лимфом. В настоящее время проводятся клинические исследования Зевалина в качестве консолидирующей терапии первой линии в лечении фолликулярных лимфом, а также В- крупноклеточных лимфом.

29 Иммунотоксины Иммунотоксины получают присоединением к МАТ бактериальных (дифтерийного токсина, экзотоксина синегнойной палочки) или растительных токсинов (рицина А или сапорина). Результаты первых клинических испытаний иммунотоксинов показали высокую перспективность метода. Единственным иммунотоксином, зарегистрированным в настоящее время для лечения злокачественных заболеваний, является гемтузумаб озогамицин (Милотарг), применяемый в терапии острого миелобластного лейкоза у пожилых. Милотарг представляет собой человеческие антитела к антигену CD33, который присутствует на большинстве лейкемических клеток, в комбинации с токсином калихимицином.

30 Перспективы развития технологии МАТ в лечении онкологических заболеваний С каждым годом МАТ все более активно применяются в лечении онкологических заболеваний. Противоопухолевые антитела составляют 50% объема рынка всех продаваемых препаратов МАТ; для сравнения: 37% рынка занимают антитела для коррекции аутоиммунных/воспалительных нарушений, 11% МАТ для лечения заболеваний органов дыхания и 2% для сердечно-сосудистых. Этот разрыв будет возрастать и дальше, так как из 400 исследований, которые ведутся сейчас с МАТ, около 250 составляют исследования в области онкологии: у больных раком молочной железы, раком яичников, колоректальным раком, у пациентов с лимфомами и немелкоклеточным раком легкого

31 Заключение Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли новые методы диагностики многих заболеваний и открылись новые пути для изучения злокачественных опухолей