Выполнила: Казбекова А.М. 205-стоматология Проверила: Объедкова Э.В. Государственный Медицинский Университет г.Семей Кафедра: Кафедра молекулярной биологии. - презентация

1 Выполнила: Казбекова А.М. 205-стоматология Проверила: Объедкова Э.В. Государственный Медицинский Университет г.Семей Кафедра: Кафедра молекулярной биологии и микробиологии Зав.кафедры: Мынжанов Масыгут Рахимович Дисциплина: Микробиология ИММУНОДИАГНОСТИКА

2 I. ВВЕДЕНИЕ. II. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ: 2.1. Виды преципитации; 2.2. Применение реакций преципитаций в практической медицине; III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. IV. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

3 Реакции преципитации (РП) [от лат. praecipito, осаждать] предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с AT. Реакция преципитации сходна по механизму с реакцией агглютинации. Они различаются тем, что в реакции агглютинации участвует цельный антиген, а в реакции преципитации – антиген в растворенном состоянии.

4 Виды реакции преципитации: В зависимости от задач и условий известно несколько методов постановки реакции преципитации: Кольцепреципитация (по Асколи) Микропреципитация Флоккуляция Преципитация в геле (агаре) Иммунодиффузии Иммуноэлектрофорез

5 (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен). Реакцией кольцепреципитации также выявляют AT к бруцеллам в молоке (кольцевая проба Банга). кольцо преципитата. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией- термопреципитации

6 Для постановки реакции необходимы * Исследуемый антиген (фильтрат бульонной культуры, экстракт микробных тел, экстракты пораженных органов, СМЖ, гной, мокрота, моча и др.) * Преципитирующая сыворотка, полученная от животных, иммунизированных специальным преципитиногеном * Физиологический раствор (Участвующие в реакции ингредиенты должны быть совершенно прозрачны. Для этого их центрифугируют или фильтруют) * Преципитационные пробирки высотой 4-6 см и диаметром 0,4-0,5 см – реакция в них наступает значительно быстрее и проявляется более четко * Микропипетки или пастеровские пипетки (для каждого ингредиента отдельная) * Штативы, резиновые груши, химические пробирки * Термостат, центрифуга

7 ++- -

8 Для выявления низких титров AT (например, при сенсибилизации к ЛС) применяют нефелометрическую реакцию микропреципитации (или реакция помутнения), предложенная Уанье (1955). При её постановке в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрации; при отсутствии AT разведение сыворотки крови Аг уменьшает её оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств AT образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды.

9

10 [от лат. floccus, хлопья шерсти] РП в системах токсин-антитоксин и анатоксин-антитоксин, проявляющиеся появлением хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке Аг. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм реакции флоккуляции обусловлен растворимостью и авидностью AT. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксинов.

11

12 Широкое распространение получили модификация реакции преципитации ( РП ) в геле; методически они отличаются от РП тем, что преципитирующая сыворотка уплотняется добавлением геля (агар, агароза, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Существует несколько видов: простая одномерная иммунодиффузия (по Удену) двойная (встречная) одномерная иммунодиффузия радиальная иммунодиффузия (по Манчини) двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по Оухтерлони)

13 Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесённого в лунки, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной диффузии AT и Аг вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии.

14

15 * Исследуемый антиген * Музейная культура токсигенных дифтерийных бактерий * Фильтровальная бумага, пропитанная специфической антитоксической противодифтерийной сывороткой * Стерильные чашки Петри с агаром ОТДМ (определение токсигенности дифтерийных микроорганизмов) * Бактериологические петли, спиртовка * Термостат

16 * На застывшую среду кладут стерильную полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором антитоксической сыворотки (1,5 х 6 см) * На расстоянии 0,8 см от края фильтровальной бумаги и друг от друга, наносят бляшки культуры музейного и исследуемого штамма диаметром 0,5 см * Помещают чашку с посевом в термостат на 24 часа

17 * Учет результатов При положительном результате у токсигенных культур между бляшками посевов и фильтровальной бумагой появляются тонкие штрихи образовавшегося преципитата. Стрелки преципитата двух рядом расположенных токсигенных штаммов сходятся между собой. Стрелки нетоксигенных штаммов не сходятся, а перекрещиваются.

18 Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

19 * В этом варианте реакции раствор, содержащий антитела, смешивается с гелем до его застывания и помещения на стекло. Антиген помещается в лунку и при его диффузии в гель, содержащий антитела, образуется зона помутнения, диаметр которой пропорционален количеству антигена. Эта модификация метода позволяет количественно определять антигены.

20 Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.

21 Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амида черным).

22

23

24

25 Применение реакции преципитации в практической медицине Реакцию преципитации используют в диагностике : * Сибирской язвы, туляремии, оспы и т.д. * При типизации и изучении антигенной структуры некоторых микроорганизмов * В судебной медицине для определения принадлежности крови, спермы * В санитарной экспертизе продуктов

26 Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных антисывороток.

27 * 1. О.К. Поздеев, учебное пособие под редакцией акад. РАМН В.И. Покровского «Медицинская микробиология», Москва, Изд.группа «ГЭОТАР-Медиа», 2010 г., стр * 2. Л.Б.Борисов, издание 4-е, дополненное и переработанное, «Медицинская микробиология, вирусология, иммунология», Медицинское информационное агентство, Москва, 2005 г., стр

28 1. Назовите метод преципитации, при котором в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрации? 2. Кем была открыта реакция преципитации? 3. В каком из методов преципитации различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом? 4. В реакции преципитации антиген участвует в растворенном состоянии, а в реакции агглютинации? 5. В каком микробиологическом лабораторном оборудовании проводят реакцию преципитации? 6. В реакции преципитации происходит выпадение видимого высадка, как он называется? 7. В каком из методов преципитации происходит появление хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке антигена? 8. Один из основных компонентов реакции преципитации? 9. При добавлении какого компонента преципитирующая сыворотка уплотняется? 10. В каком методе преципитации между двумя средами образуется непрозрачное кольцо преципитата? 11. Один из основных компонентов реакции преципитации? 12. Этот вид реакции отличается от реакции преципитации тем, что в нем участвует цельный ген, а в реакции преципитации – антиген в растворенном состоянии. Какой это вид реакции?

29 ПРЕЦИПИТАЦИЯ 12

30 А 7Г 3ФГ ИЛЛ МОЮ 1МКТ МУ5К10И ИНПУК11Н КОРЛ8ОАА Р2ЭОЯАЛНЦ ОКЛ4Б6ЦН9ЬТИ ПРЕЦИПИТАЦИЯ РАКЕРРЯИГЕТ12 ЕУРЛКЕГАПЕ ЦСОЬАЦЕРРЛ ИФНИНЕО ПОЫПЦ ИРЙИИ ТЕТП АЗАИ ЦТТ ИА ЯЦ И Я