ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОГО ИНДЕКСА - презентация

1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОГО ИНДЕКСА Традиционным методом оценки стадии поглощения является подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный индекс), и количество частиц, захваченных одной клеткой (фагоцитарное число). Анализ таких препаратов может проводиться с помощью светового и люминесцентного микроскопов. Классическим методом оценки поглощения частиц фагоцитами является микроскопический метод, когда из образца, содержащего фагоцитировавшие лейкоциты, делают мазок, фиксируют его, докрашивают клеточными красителями (по Романовскому-Гимза) и изучают под световым микроскопом. В качестве объекта фагоцитоза используют различные бактерии, дрожжевые грибы, простейшие или синтетические частицы (латекс, зимозан) в опсонизированном или неопсонизированном виде. Подсчитываются фагоцитарное число и фагоцитарный индекс. Рыбалко Александра

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОГО ИНДЕКСА Оценка поглощения с помощью проточной цитометрии является наиболее точным, быстрым и объективным методом оценки, чем изучение данного процесса с помощью микроскопии. К настоящему времени разработан ряд методов оценки поглощения различных микроорганизмов с помощью ПЦ: дрожжей, стафилококка, кишечной палочки, листерий, туберкулезной палочки и т.д. Для мечения микроорганизмов применяются различные красители. Наиболее популярным стал флюоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) вследствие его химической стабильности, способности хорошо связываться с белками в щелочной среде и отсутствия взаимодействия с субстратами при физиологических значениях рН. Рыбалко Александра

3 Основные этапы реакции Для изучения поглощения, внутриклеточного киллинга стафилококка или дрожжей микробные клетки в концентрации 200 млн/мл красят флюорохромом ФИТЦ из расчета 0,1 мг/мл в течение 12 ч при +4 °С в карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,5. ФИТЦ, не связавшийся с микробом, удаляют трехкратной отмывкой при 1000g. Аналогичным путем красят C. albicans. В лунку круглодонного 96-луночного планшета помещают взвесь ФИТЦ-меченого стафилококка и лейкоцитарную взвесь в соотношении лейкоцит/микроб 1:10. Инкубируют 20 мин при 37 °С. Лейкоциты осаждают центрифугированием при 200g 1,5 мин при +4 °С. Эритроциты убирают лизирующим раствором. Лейкоциты однократно отмывают охлажденным ФСБ с 0,02% ЭДТА, который способствует прекращению поглотительной активности клеток и удалению несвязавшегося стафилококка. Образцы фиксируют охлажденным раствором ФСБ, содержащим 2% параформальдегида и 0,02% ЭДТА. Приготовленные таким образам пробы можно хранить до 2 сут при +4 °С. Рыбалко Александра

4 Основные этапы реакции В зависимости от задач исследования в реакции фагоцитоза микробы могут использоваться как неопсонизированные, так и опсонизированные. Опсонизация микробов и других корпускул может осуществляться половой сывороткой, сывороткой исследуемого индивидуума, препаратами иммуноглобулинов, комплемента и др. Фагоцитоз микробов, опсонизированных половой сывороткой, происходит в основном за счет взаимодействия таких микробов с рецепторами лейкоцитов FcyR и CD11b/CD18. В известной степени этот фагоцитоз отражает функциональное состояние этих рецепторов. Фагоцитоз микробов, опсонизированных IgG, полученного из половой сыворотки, происходит только за счет взаимодействия этих микробов с FcyR лейкоцитов. Фагоцитоз частиц зимозана, опсонизированных половой сывороткой, протекает в основном за счет взаимодействия этих микробов с CD11b/CD18 лейкоцитов. Сопоставление фагоцитоза микробов, опсонизированных половой сывороткой и микробов, опсонизированных сывороткой исследуемого больного, отражает состояние опсонизирующих факторов в сыворотке больного. Эта схема опсонизации имеет отношение не только к определению процента фагоцитирующих клеток, но и к определению фагоцитарного числа. Рыбалко Александра

5 Основные этапы реакции Приготовленные пробы анализируют на проточном цитофлуориметре. Настройки устанавливают таким образом, чтобы в окне Dot Plot размещались три облака клеток - нейтрофилы, моноциты и лимфоциты. Также на экран выводили гистограммы по FL1 для нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов и соответствующие статистики (рис. 2.3, см. на вклейке). Процент флуоресцирующих (фагоцитировавших) нейтрофилов и моноцитов высчитывается автоматически. Этот параметр выводится в соответствующих гистограммам таблицах статистики (табл. 2.3). Таблица 2.3 Фагоцитарный индекс лейкоцитов периферической крови доноров при поглощении стафилококка (Μ±σ) Нейтрофилы Моноциты Без сыворотки 22,7±5,429,5±6,8 Опсонизация IgG66,8±7,160,1±9,7 Опсонизация половой сывороткой 90,6±4,580,2±6,2 Рыбалко Александра