Қысқаша тарихы ПТР - әмбебап әдіс, себебі бөтен ДНК-ны әр түрлі биологиялық материалдардан – шырыш, зәр, қан, қақырық, эпителиалді жасушалар қырындысынан. - презентация

1

2 Қысқаша тарихы ПТР - әмбебап әдіс, себебі бөтен ДНК-на әр түрлі биологиялық материалдардан – шырыш, зәр, қан, қақырық, эпителиалді жасушалар қырындысынан анақтауға мүмкіндік береді. Бұл әдістердің көмегімен миллихондаған ДНК фрагменттері ішінен керекті фрагментті табуға мумкіндік туады. Полимеразды тізбекті реакцияна ең алғаш 1983 жилы американдық ғалым К.Мюллис ашқан және ол осы ашқан жаңалығы үшін Нобель сыйлығына ие болған. Себебі ПТР мүмкін емсті мүмкін етті.

3 Қолданаллы: ПТР диагностика жұқпалы аурулар қоздырғышын басқа әдістермен (иммунологиялық, бактериологиялық, микроскопиялық) анақтау мүмкін болмаған жағдайда қолданаллоды. Қазіргі таңда ПТР-на: археология, медициналық практика да әр түрлі тұқым қуалау, жұқпалы ауруларда, сот медициналық сараптамасында, генетика да әкесін анақтауда;

4 Әдіс жайлы Әдіс бойынша ДНҚ-наң алғашқы молекула сын бірнеше рет репликациялау кезінде ДНҚ-на амплификациялау қажет. Бұл үрдісті ДНҚ-полимераза катализдейді.Бірақ әрбір қыздыру-салқындату циклінде реакциялық қоспаға ДНҚ-полимеразана жаңадан кіргізу керек баллоды, себебі қыздыру әсерінен фермент инактивацияға ұшырайды жилы темофильдік бактериялардан ДНҚ-полимеразаларды бөліп аллы арқасында ПТР-да қолдану кушті нәтиже берді. Бұл ферментер термостабильді және реакциянаң көп қайталанатын циклдеріне шыдамдылық көрсетті. Оған қоса оларды пайдадану барысында ПТР-ді жүргізуді автоматтандыруға мүмкіндік труды. Thermus aquatiqus бактериясынан термостабильді Tag полимераза бөлініп аллоды, бірақ бұл ферменте қателікті түзейтін механизмі жоқ. Архейлерден алынган phu- жене pwo полимераза лорда репликация реакция сын жургізе аллоды. Олардың артықшылығы ДНҚ-да мутациялар өте аз байқаллоды, бірақ Tag-ка қарағанда реакция жил дамдығы төмендеу. Сондықтан Tag- жене phu- полимеразаларды қосып пайдалануға тырысады.

5 ПТР әдісі in vitro жағдайында ферментер көмегімен ДНҚ-наң белгілі бөліктерін бірнеше комплементарнаққа сәйкес іріктеу жолымен көшірмелеуіне негізделген. ПТР көмегімен ДНҚ-наң салыстырмалы қысқа бөліктері амплификацияланады. Әдетте көшірген ДНҚ бөліктерінің ұзындығын 3000–дай жұп негіздер құрайды.

6 Полимеразалық тізбектік реакция

7 Реакция кезеңдері ДНҚ тізбектері атырау үшін 0,5-2 мин. қос тізбекті ДНҚ матрицана 94-96° С дейін қыздырады. Бұл кезеңді денатурация деп атайды, өйткені ДНҚ тізбектері арасындағы сутектік байланастар үзіледі. Тізбектер ажырағаннан кейін температурана 50-60°С дейін төмендетеді. Сол кезде праймерлер бір тізбекті матрица мен комплементарна байланасады. Температура жоғары бокса, праймер нашар байланасады, ал төмен бокса праймер баска бөлікпен байланасып, дұрыс нәтиже бериейді. Праймер Tag- полимераза үшін баста уши кызметін атқарады. Праймер З-ұшында ОН- чтобы бар, седан кейін ДНҚ,- полимераза репликация реакция сын бастап, матрица аяғына дейін жатады. Кейінгі репликация реакция сын жүргізу үшін температурана 72°С дейін жоғарылатады. Реакция ұзактығы 1-2 мин ДНҚ синтезі 5'>3' бағытта жүреді.

8

9 Келесі циклды жоғарыдағыдай ретпен жүргіземіз 94-96° С қыздырып тізбектерді ажырату 50-60°С праймерін қосу 70-72° С ДНК синтезі Екінші цикл нәтижесінде керекті реттерден тұратын таза eкi бір тізбекті ДНК түзіледі. Үшінші циклде 8 молекула ДНК синтезделеді. Солардың eкeyi керекті реттерден ғана тұратын қос тізбекті ДНК болады, ал төрт қос тсзбекті ДНК-наң бip тізбектері керекті реттерден турады. Циклдерді apы карай жалгастырган сайын тек керекті реттерден гана туратын кос тізбекті ДНК геометрия лык прогрессия принципімен арта береді. Төртінші циклде олардыц сана 8-ге, бесінші циклде 22, ал 20 циклде , 30 циклде - 1, ке жетеді. Мундай керекті peттepi бар ДНК-на ампликон дейді. Егер 6ip цикл 3 минута болады деп есептелінсе, хонда 2 сагат ішінде ДНК-наң миллиард таган копия сын (ампликонды) калуга болады.

10 ПТР-дің модификация лары Бір-біріне кіргізілген ( nested PCR) Кері транскрипциялық ПТР ( PT PCR ) Сандық ПТР Ұзын фрагментті ПТР ( Long range PCR) Инвертирлік ( Inverse PCR ), Асимметриялық ПТР ( asymmetric PCR ), Кездейсоқ амплификацияланған полиморфтық ДНҚ-лар ( RAPDs) In situ ПТР ( Prims) ISH әдісі секілді Мультикомплекстік ПТР (multi PCR) Метил-спецификалық ПТР

11 PCR Real Time Амликхондардың санан флуоресцентті анақтаудың екі әдісі бар: 1. – ДНК-мен спецификалық емс байланасатын химиялық агенттерді қолдану 2. – Флуоресцентті зхондарды қолдану (TagMan зонды және Молекулярлық скорпихондар (Molecular beacons) )

12 1. – ДНК-мен спецификалық емс байланасатын химиялық агенттерді қолдану Спецификалық емс бояғыштар ДНК-наң бір тізбегімен емс, қос тізбегімен байланасады. Кеңінен қолданалатына - SibrGreen1 бояғышы. Реакциялық қоспаға SibrGreen1 бояғышын қосқанда ДНК-наң қос тізбегімен байланасып, флуоресцент интенсивтілігі көбейеді. Денатурация процесі кезінде ДНК тізбегінен алыстайды және флуоресцент интенсивтілігі азаяды. Полимеризация сатысында бояғыш ПЦР-дің өнімімен қайтадан бірігеді. Полимеризация аяқталғанда бояғыш нуклеин қышқылымен толығымен байланасады. Және бұл флуоресцент интенсивтілігінің тез көбеюіне әкеледі.

13 2. – Флуоресцентті зхондарды қолдану

14 PCR Real Time артықшылықтары Сынама құрамы және жүріп жатқан реакция жайлы информацияна пробиркана ашпай-ақ білуге болады. Бұл нәтижені тез алуға және контаминациянаң максималлоды аз болуына көмектеседі. Бір реакция да бірнеше инфекционды агенттерді флуоресцентті бояғыштардың көмегімен тіркеуге болады.

15 Амплификатор Амплификатор (термоциклер) құралы 0,1 °С дәлдікпен мезгіл мезгіл пробиркаларды салқындатып, қыздырып тұрады. ПТР үшін флуоресценттік детектор мен жабдықталған құралдар жасалған. Автоматталған қақпағы және микропланшет тер үшін бөлімдері бар құралдар шығарылады, оларды автоматталған жүйелерге қосуға болады. PCR Reat Time – флюориметрмен бірге арнайы амплификаторда жүргізеді. ПТР процесінде амплификация результаты есептеліп шығады. Кеңінен қолданалмайтын себебі – құраллодың қымбат тұруы.

16 ПТР артықшылықтары 1) Жұқпалы ауруларды қоздырушылардың диагностикасында ПТР өте сезімтал және арнайылығы жоғары әдіс болады 2) Диагностикана жургізуде әр турлі клиникалық материаллоды қолдануға болады (қан, сілекей т.б) 3) Бір мезгілде 6ip биологиялық сына мода 6ipнеше микроорганизмді анақтауға мүмкіндік береді 4) Зертханаға материаллоды жеткізгенде ауру қоздырғышты тірідей алып колу міндетті емс 5) Анализ өте жил дам жасаллоды 6) Кейбір микроорганизмдерді тек ПТР-мен анақтайды, мыс. Mycoplasma genitalium 7) Кейбip жұқпалы аурулар симптомсыз, яғни ауруға тән белгілер берией өтеді. Сондықтан ПТР қолданғанда ауру қоздырғыштардың барин табуға мүмкіндік береді. Мысалы, гонорея, хламидиоз т.б.

17 Зерттеу ұзақ уақытты қажет етпейді. Қазіргі жаңа технологиянаң дамыған кезеңінде қоздырғышты бөліп алу және өсіру, одна нуклеин қышқылын бөліп алу үрдістері толығымен стандартталған және автоматтандырылған. Әдістің автоматизациялығы қолмен жүргізілетін зерттеу кезінде кездесетін мүмкін қателіктерді азайтады. Нәтиже бірнеше сағаттың ішінде алынуы мүмкін.

18