Работу выполнила: студентка Педиатрического факультета 250 группы Смирнова Екатерина. - презентация

1 Работу выполнила: студентка Педиатрического факультета 250 группы Смирнова Екатерина

2 Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген- антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ- инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях ( г г/л).антиген антитело антигена антител Из-за разнообразия объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода. Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.антитела

3 Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген- антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрический или визуально. Ферментативнаяспектрофотометрический «Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.ВИЧ-инфекциягепатиты цитомегаловируснаягерпесная

4

5 Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата: Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованные на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом. К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена. Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.антитела антигенантителом В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген- белок-носитель. Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена. Применение универсального реагента меченых антивидовых антител даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.антитела антиген антигена

6

7 Твердофазный ИФА вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело ) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания. I. При определении антител (рис. 7.63) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента. И. При определении антигена (рис. 7.64) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента. Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65). Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.антителоантителантигенов антигеномантигенаантителамиантигенантитела антигеновантитела антигены

8 Рис Определение антител в сыворотке крови больного (в лунках планшеток с сорбированным антигеном) Рис Определение антигена в сыворотке крови больного (в лунках планшеток с сорбированными диагностическим и антителами) Рис Искомый антиген (1) и меченый ферментом антиген (2) конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе

9 Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложноположительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества суперантигены неспецифический стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. [1] Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.ревматоидного фактора [1] Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

10 Основные типы тест-систем в зависимости от используемых антигенов В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест- системы подразделяют на: Лизатные в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре); Рекомбинантные в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя; Пептидные использующие химически синтезированные фрагменты белков. Общее направление развития ИФА-диагностикумов это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным. Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена. Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам). Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% специфичностью при высокой чувствительности. На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

11 Гормоны и маркеры заболеваний щитовидной железыщитовидной железы Тиреопероксидаза (ТПО) Тиреоглобулин (ТГ) Тиреотропный гормон (ТТГ) Тироксин (Т4) Трийодтиронин (Т3) Свободный тироксин (Т4) Свободный трийодтиронин (Т3) Диагностика репродуктивной функции Лютеинизирующий гормон (ЛГ) Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) Хорионический гонадотропин (ХГ) Пролактин Прогестерон Эстрадиол Тестостерон Кортизол Стероид связывающий глобулин (ССГ) Альфафетопротеин (АФП) Онкомаркеры Хорионический гонадотропин (ХГ) Простатспецифический антиген (ПСА) СА – 125 СА – 19.9 CYFRA – 21-1 М – 12 (СА – 15.3) MUC – 1 (M – 22) MUC1 (M – 20) Альвеомуцин К – цепь L – цепь Фактор некроза опухолей (ФНОα) γ – интерферон Раково-эмбриональный антиген (РЭА)

12 Диагностика инфекционных заболеваний Токсоплазма Токсоплазма (IgG, IgM) Краснуха Краснуха (IgG, IgM) Цитомегаловирус Цитомегаловирус (IgG, IgM) Герпес Герпес (IgG, IgM) Туберкулез Туберкулез (IgG, IgM) Корь Корь (IgG, IgM) Гепатит Гепатит Д, Е, А (ВГД, ВГЕ, ВГА) Гепатит Гепатит С (ат ВГС, ВГСсore) Гепатит В (НВs, НВе НВсore) Уреаплазма Уреаплазма (IgG, IgM) Микоплазма Микоплазма (IgG, IgM) Хламидия Хламидия (IgG, IgM) Микоплазма (IgG) Сифилис Сифилис (IgG) Аспергиллёз (IgG) Лямблии Лямблии (IgG) Helicobacter Pylori (IgG) Псевдотуберкулез (IgG, IgM) Кандида Кандида (IgG) Герпес (IgG, IgM) Эпштейн-Барр (IgG, IgM) Цитомегаловирус (IgG, IgM) Диагностика аутоиммунных заболеваний и определение иммунного статуса IgE – общий С-реактивный белок (СРБ) Глиадин (IgG, IgA) IgG4 Общий IgG IgG2 Общий IgA Секреторный IgA Общий IgD Общий IgМ Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) Маркеры заболеваний сердца Тропонин I

13