Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Система клонирования белков, обладающих антимикробной активностью. - презентация

1

2 Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра микробиологии Система клонирования белков, обладающих антимикробной активностью Магистерская диссертация Совгир Натальи Владимировны Научный руководитель д.б.н., профессор Прокулевич Владимир Антонович Минск 2009

3 Антимикробные пептиды (antimicrobial peptides) - очень короткие белковые молекулы, состоящие примерно из аминокислот, которые вырабатываются клетками животных и человека для борьбы с микробами Антимикробные пептиды - часть системы врожденного иммунитета животных. В отличие от антител, они не модифицируются в течение жизни организма и не "подстраиваются" под новые виды возбудителей

4 Актуальность выбранного направления работы В последнее время актуальна проблема устойчивости штаммов бактерий к традиционным методам терапии, связанных с использованием широкого спектра антибиотических веществ. Бактерии приспосабливаются к любым видам антибиотиков, что сводит на нет все усилия по борьбе с инфекцией, и может привести к полному отказу от антибиотического воздействия на возбудителей инфекционных заболеваний Кроме того, участились случаи заболевания сельскохозяйственных животных эндометритами и маститами, имеющими бактериальную этиологию. Лечение животных по указу вет управления с использованием антибиотиков проводить нежелательно, в связи с чем необходимо осуществлять поиск новых препаратов

5 Согласно литературным данным, к настоящему времени наиболее изучены пять антимикробных пептидов (temporin A, B и G, esculentin 1b и bombinin H2), выделенных из кожи трех различных видов лягушек и жаб (Rana temporaria, Rana esculenta и Bombina variegata). Все пептиды являются эффективными антибактериальными агентами : temporin A, B и G более эффективны против грамположительных бактерий и действуют при С = от 0,5 до 48 µМ esculentin 1b проявляет активность через 2-20 минуты в основном против грамотрицательных микроорганизмов при С = от 0,5 до 32 µМ bombinin H2 аналогично действует на все виды штаммов бактерий при С = от 4 до 16 µМ

6 Объект изучения В качестве объекта изучения выступает белок эскулентин который, согласно проведенным исследованиям, активно убивает лекарственно-устойчивые штаммы грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium) в средних и низких концентрациях, и в более низких концентрациях,грамотрицательные штаммы (Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa). Активность молекулы эскулетина семейства 1b обусловлена N-концевой областью (1-18) Из 5 вышеупомянутых антибактериальных белков эскулентин характеризуется наибольшей длинной пептидной цепи (138 аминокислот) и наличием небольшого числа триплетов, кодирующих не характерных для бактерии E. coli аминокислоты

7 Целью работы является разработка системы клонирования белков, обладающих антимикробной активностью, с использованием плазмиды pET-24a на основе штамма E. coli XL-1blue

8 Задачами работы являются: 1. Клонирование гена антимикробного белка эскулетина 2. Оптимизация условий экспрессии для получения максимального выхода целевого продукта 3. Очистка белкового продукта и оценка возможности его использования в качестве препарата для лечения эндометритов и маститов сельскохозяйственных животных

9 Этапы проведения работы На первом этапе был синтезирован ген эскулетина с использованием праймеров F1, R1, F2 и R2. Данные праймеры были сконструированы на основе имеющихся в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации последовательностей Праймер Нуклеотидная последовательность 5'-3' F1 5 ccgtccttaaaagaggtttaaccggccctttttcgaaccg 3 R1 5 cgcctacattcttgagtccgcttatgagcaaatttttcgt 3 F2 5 gggcgttccttcaaccgtacctgcaccactcttgaccgtcga 3 R2 5 caccatcacctttaattttacaacctgcaatgtctaggc 3 Характеристика праймеров F1, R1, F2 и R2

10 На следующем этапе синтезированный ген эскулетина был использован в качестве матрицы для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции. Размер ожидаемого продукта равен 150 н.п. Рис. 1. Результаты амплификации гена эскулетина с использованием праймеров F1, R1, F2 и R2 Дорожка 1 – продукт амплификации при температуре отжига 60°С Дорожка 2 – маркер молекулярного веса Fermentas SM Продукт амплификации затем был подвергнут рестрикции с использованием рестриктаз NdeI (сайт рестрикции CATATG) и XhoI (сайт рестрикции AAGCTT)

11 Затем ген эскулетина был клонирован в вектор экспрессии pET-24a(+), которым был трансформирован штамм Escherichia coli XL-1Blue Рис. 2. Карта вектора экспрессии pET-24a(+): T7 промотор Полилинкер (BamH1 – Xho1) Последовательность, кодирующая His-Tag T7 терминатор Последовательность, кодирующая lac Последовательность, отвечающая за устойчивость к Kam

12 После индукции ИПТГ был получен белковый продукт, который по размеру соответствовал белку эскулетину (около 19 к Да) Рис. 3. Электрофорез суммарных клеточных белков штамма Escherichia coli XL-1Blue (pET-24b(+)+Esc) Дорожка 1 – белки-стандарта молекулярных масс (сверху вниз: 116 к Да, 66 к Да, 45 к Да, 35 к Да, 25 к Да, 18,4 к Да, 14,4 к Да) Дорожка 2 – через 4 ч. после индукции ИПТГ в концентрации 0,4 м Моль/л Дорожка 3 – без индукции ИПТГ к Да

13 С использованием сконструированных праймеров синтезирован и амплифицирован ген антимикробного белка эскулетина Продукт амплификации клонирован в вектор экспрессии Полученный белковый продукт полностью соответствует белку эскулетину Выводы

14 Спасибо за внимание ! Exit