Группы методов лабораторной диагностики Прямые Прямые выявляют инфекционный агент Непрямые (косвенные) Непрямые (косвенные) выявляют ответ организма на. - презентация

1 Группы методов лабораторной диагностики Прямые Прямые выявляют инфекционный агент Непрямые (косвенные) Непрямые (косвенные) выявляют ответ организма на инфекционный агент

2 Непрямые методы Все серологические реакции – РСК, РТГА, РПГА, ИФА и т.д. Все серологические реакции – РСК, РТГА, РПГА, ИФА и т.д. Несомненные плюсы Несомненные плюсы ответ появится независимо от места локализации процесса ответ появится независимо от места локализации процесса дают представления об ответе организма на ПБА дают представления об ответе организма на ПБА можно определить стадию заболевания можно определить стадию заболевания Минусы Минусы подходят только для инфекционных заболеваний подходят только для инфекционных заболеваний наличие «серологического окна» наличие «серологического окна» малая информативность в случае иммунодефицита малая информативность в случае иммунодефицита целый ряд инфекций встречается и у здоровых пациентов целый ряд инфекций встречается и у здоровых пациентов

3 Прямые методы Микроскопия Микроскопия ИФА на антигены ИФА на антигены ПЦР ПЦР Культуральный метод Культуральный метод

4 Особенности прямых методов Врач должен знать стадии течения и представлять, где в какую стадию инфекционный агент может быть. Врач должен знать стадии течения и представлять, где в какую стадию инфекционный агент может быть. Важно грамотное взятие материала. Важно грамотное взятие материала. Надо помнить, что понятия «ИНФИЦИРОВАННОСТЬ» и «ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС» - не тождественны. Надо помнить, что понятия «ИНФИЦИРОВАННОСТЬ» и «ИНФЕКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС» - не тождественны. Отрицательный результат при некорректном методическом подходе не исключает факта заболевания. Отрицательный результат при некорректном методическом подходе не исключает факта заболевания.

5 Место ПЦР среди прямых методов лаб.диагностики Световая микроскопия Бак.посев ПЦРИФА Ряд микроорганизмов не визуализируется Схожесть морфотипов Субъективность оценки Высокая скорость проведения анализа Трудности транспортировки и хранения материала до исследования Ряд микроорганизмов трудно или невозможно культивировать В процессе роста теряется соотношение Есть чувствительность к а/б Низкая скорость Скрининг – ДА или НЕТ Количественная оценка Динамические наблюдения Нет чувствительности к а/б Высокая скорость Доступность для лаборатории Быстрота получения результата. Качественная или количественная оценка. Динамическое наблюдение при количественном определении.

6 Тем не менее: Ни один метод не является абсолютом, исключающим все остальные Ни один метод не является абсолютом, исключающим все остальные Лучше всего комбинировать прямые методы с косвенными Лучше всего комбинировать прямые методы с косвенными Результаты лаборатории врач должен сопоставлять с клинической картиной Результаты лаборатории врач должен сопоставлять с клинической картиной

7 Иммунохимические методы При взаимодействии антигена и специфического иммуноглобулина (АТ) образуется высокомолекулярный комплекс. Можно определять АТ с помощью специфических АГ, можно определять АГ с помощью специфических АТ. При взаимодействии антигена и специфического иммуноглобулина (АТ) образуется высокомолекулярный комплекс. Можно определять АТ с помощью специфических АГ, можно определять АГ с помощью специфических АТ.

8 1) Методы преципитации в геле (иммунодиффузия). 1) Методы преципитации в геле (иммунодиффузия). 2) Методы лигандного анализа. 2) Методы лигандного анализа. 3) Иммунотурбидиметрия. 3) Иммунотурбидиметрия.

9 Определение индивидуальных белков на основе реакции взаимодействия антиген-антитело. При взаимодействии АГ с АТ образуется иммунный комплекс, который может выпадать в виде преципитата. Реакция преципитации была использована в методе радиальной иммунодиффузии, предложена в гг.. Манчини Карбонара и Херемансом.

10 Метод радиальной иммунодиффузии не требует специального оборудования, но он довольно длительный, не поддается автоматизации. Метод радиальной иммунодиффузии не требует специального оборудования, но он довольно длительный, не поддается автоматизации. Реакция между АГ и АТ в жидкой фазе. Реакция между АГ и АТ в жидкой фазе. Метод турбидиметрии и нефелометрии. Метод турбидиметрии и нефелометрии.

11 Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц, то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости. Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц, то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости.

12 Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов. Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов.

13 Реакция АГ-АТ проявляется в растворе в виде образования агрегатов. Реакция АГ-АТ проявляется в растворе в виде образования агрегатов.

14

15

16 Лигандный анализ. Лигандный анализ. специфическое связывание с лигандами как аналитический метод начинается с работы Ялоу и Берсон, предложивших в 1960 году метод радиоиммунологического определения (РИА) инсулина. Эта работа была удостоена Нобелевской премии. специфическое связывание с лигандами как аналитический метод начинается с работы Ялоу и Берсон, предложивших в 1960 году метод радиоиммунологического определения (РИА) инсулина. Эта работа была удостоена Нобелевской премии.

17

18 В лигандном анализе выделяют три компонента: В лигандном анализе выделяют три компонента: 1) АНАЛИТ- определяемое вещество. Оно может содержаться в анализируемом материале, может быть добавлено в качестве калибратора и т.д.. 2) ЛИГАНД- вещество, избирательно связывающееся с анализом. 3) МЕТКА- легко определяемое соединение, добавляемое в аналитическую систему для измерения количества анолита.

19 ЭТАПЫ: ЭТАПЫ: 1. Взаимодействие анолита с лигандом. 2. Формирование меченного комплекса. 3. Измерение сигнала (определение количества метки).

20 ОСНОВНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ: 1.Прямые- определяется количество комплекса аналит- лиганд. При увеличении концентрации анолита сигнал возрастает. 1.Прямые- определяется количество комплекса аналит- лиганд. При увеличении концентрации анолита сигнал возрастает. 2. Непрямые- определяется количество оставшихся свободными валентностей лиганда. 2. Непрямые- определяется количество оставшихся свободными валентностей лиганда.

21

22 3. Конкурентные – обычно непрямые 3. Конкурентные – обычно непрямые 4. Неконкурентные- обычно прямые 4. Неконкурентные- обычно прямые 5. Гомогенный анализ. 5. Гомогенный анализ. К гомогенному анализу относится метод поляризации флюоресценции. В качестве метки используется исследуемое вещество, к молекуле которого пришита флюоресцирующая группа. Смешивают растворы анолита, лиганда и метки; реакция протекает быстро, поляризации флюоресценции метки измеряют.

23 Интенсивность поляризованного света пропорциональна количеству связавшейся метки. Аналит конкурирует связыванию метки, при увеличении его концентрации интенсивность поляризованного света (сигнал) уменьшается. Метод используется для анализа гаптенов, лекарственных и токсичных веществ. Преимущества метода: быстрота, специфичность. Ограничения: необходимость дорогостоящей аппаратуры.

24

25 Гетерогенный анализ отличается от гомогенного тем, что в реакционной смеси имеются две фазы- твердая( осадок, суспензия) и жидкая, что позволяет отделить комплекс от исходных компонентов. Гетерогенный анализ отличается от гомогенного тем, что в реакционной смеси имеются две фазы- твердая( осадок, суспензия) и жидкая, что позволяет отделить комплекс от исходных компонентов. Самый распространенный вариант гетерогенного анализа- это твердофазный, когда с самого начала один из компонентов реакции фиксирована твёрдом носителе. Широко распространен вариант ELISA ( ensime linked immunosorbent assay). Самый распространенный вариант гетерогенного анализа- это твердофазный, когда с самого начала один из компонентов реакции фиксирована твёрдом носителе. Широко распространен вариант ELISA ( ensime linked immunosorbent assay).

26

27 Фотометрия в современной лаборатории

28 А кал. А реаг. С кал. А (опт. плотн.) С (конц.) А обр.1 С обр.1 С обр.2 А обр.2 Измерения по «конечной точке» Калибровочный график (зависимость оптической плотности от концентрации) Кривая реакции (изменение оптической плотности в зависимости от времени) А обр. - А реаг. С обр. = х С кал. А кал.. - А реаг. А (опт. плотн.) Т (время) Т0Т0 ТnТn А кон. А нач. А

29 Кинетические измерения Т (время) А (опт. плотн.) t0t0 t1t1 t2t2 t3t3 А3А3 А2А2 А1А1 А0А0 Кривая реакции (увеличение оптической плотности в зависимости от времени) Кривая реакции (уменьшение оптической плотности в зависимости от времени) А кон. А нач. А lim t = 37° C t = 25° C25° 37° C (А 1 - А 0 ) + (А 2 – А 1 ) + (А 3 – А 2 ) С обр. = х F t 3 – t 0 А (опт. плотн.) Т (время) А А нач. А кон. Т нач. Т кон. t

30 Нелинейная многоточечная калибровка С (конц.) А (опт. плотн.) С1С1 С2С2 С3С3 С4С4 С5С5 А4А4 А3А3 А2А2 А1А1 А5А5 Эквивалентность Избыток антитела Избыток антигена Количество преципитата Концентрация антигена Кривая реакции (изменение оптической плотности в зависимости от времени) Калибровочный график (зависимость оптической плотности от концентрации)

31 Реакция АГ-АТ проявляется в растворе в виде образования агрегатов. Реакция АГ-АТ проявляется в растворе в виде образования агрегатов.

32 Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов. Турбидиметрия- измерение прошедшего света по закону Бугера- Ламберта (18 век). В качестве турбидиметра можно использовать большинство фотометров и биохимических анализаторов.

33 Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц, то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости. Нефелометрия-измерение рассеянного света. Если известны размеры частиц, то интенсивность рассеянного света при фиксированном угле измерения будет пропорциональна концентрации вещества. Приборы для нефелометрии программируются под измерение определенных компонентов биологической жидкости.

34 Что же такое современный фотометр?

35 Требования предъявляемые к современному фотометру: Низкая стоимость. Простота эксплуатации и удобный интерфейс. Высокая точность измерений. Возможность программирования. Малый объем реакционной кюветы. Гарантийное и послегарантийное обслуживание. Возможность кинетических измерений. Совместимость с компьютером. Наличие или возможность подключения проточной кюветы.

36 Классическая оптическая схема фотометра Зеркало Карусель с фильтрами Кювета Кюветное отделение Конденсорные линзы Промежуточная диафрагма Теплозащитный фильтр Интерференционный светофильтр Фотоприемник референсного луча Фотоприемник Проекционная линза Светоделительная пластина Диафрагмы

37 Конденсорные линзы Фотоприемник референсного луча Кювета Светоделительная пластина Зеркало Интерференционный светофильтр Теплозащитный фильтр Диафрагмы Промежуточная диафрагма Классическая оптическая схема фотометра Проекционная линза Фотоприемник

38 Конденсорная линза Фотоприемник Кювета Интерференционный светофильтр Диафрагмы Упрощенная оптическая схема фотометра

39 Влияние квазипаралельности светового потока и длины волны

40 Влияние юстировки лампы

41 Ольвекс Диагностикум представляет ROKI Биохимический анализатор

42 Включите прибор. Для повседневной работы в режиме запрограммированных методик выберите режим F4 нажатием клавиши [F4]. Нажатием клавиши [MODE] выберите требуемую для работы методику. Кюветное отделение прибора прогревается до 37º С. В это время на индикаторе горит надпись: «Подождите пожалуйста». ПОРЯДОК РАБОТЫ НА БИОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗАТОРЕ ROKI ВКЛЮЧЕНИЕ ПРИБОРА И ВЫБОР МЕТОДИКИ

43 Установите в кюветное отделение кювету с исследуемым образцом и нажмите клавишу [START]. Для дальнейших измерений установите в кюветное отделение кювету с очередным образцом и нажмите клавишу [START]. После окончания измерения серии образцов нажмите клавишу [STOP] и уберите кювету из кюветного отделения. Установите в кюветное отделение кювету с раствором сравнения и нажмите клавишу [ZERO]. Появляется надпись [Подождите!] и происходит автоматическая установка светофильтра и измерение базовой величины оптической плотности. Установите в кюветное отделение кювету со стандартным образцом и нажмите клавишу [START]. На 2 секунды появляется значение оптической плотности стандартного образца. Для выбора новой методики нажмите клавишу [MODE]. ПОРЯДОК РАБОТЫ НА БИОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗАТОРЕ ROKI ИЗМЕРЕНИЕ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» «Холостой» Стандарт Проба Проба реагент

44 После последнего измерения на индикаторе отображается концентрация вещества (активность фермента) в исследуемом образце. Для окончания работы нажмите несколько раз клавишу [STOP] до выхода в главное меню, вытащите кювету из кюветного отделения и выключите прибор. Добавьте к прогретому до 37º С реагенту исследуемый материал, быстро перемешайте, вставьте в кюветное отделение и нажмите клавишу [START]. Установите в кюветное отделение кювету с раствором сравнения и нажмите клавишу [ZERO]. Появляется надпись [Подождите!] и происходит автоматическая установка светофильтра и измерение базовой величины оптической плотности. Стартует процесс кинетических измерений. На индикаторе последовательно отображаются интервал измерения и далее значения оптических плотностей, измеренных в конце интервалов измерений. ПОРЯДОК РАБОТЫ НА БИОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗАТОРЕ ROKI КИНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ «Холостой» Стандарт Проба Проба реагент

45

46 Карусель с фильтрами Теплозащитный фильтр Интерференционный светофильтр Конденсорные линзы Фотоприемник референсного луча Фотоприемник Светоделительная пластина Диафрагмы Проекционная линза Промежуточная диафрагма Зеркало Кювета

47

48

49

50 Некоторые цифры В 150 из 350 биохимических лабораториях Санкт-Петербурга установлено и работает 498 фотометров старого поколения (преимущественно КФК-2 и КФК-3), 59 современных полуавтоматических анализаторов и 17 полностью автоматических анализаторов. Из биохимических исследований проводимых в месяц, 72% ( ) приходится на фотометры старого поколения. Цифры говорят сами за себя.

51 Влияние квазипаралельности светового потока и длины волны

52 Влияние квазипаралельности светового потока

53 Будьте здоровы!!!