Высокоэффективная жидкостная хроматография при определении поллютантов в объектах морской среды

Высокоэффективная жидкостная хроматография Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, англ. HPLC, High performance liquid chromatography) один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый в аналитической химии. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии. Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна (элюент). Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 35 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). 2

Определение поллютантов в объектах морской среды методом ВЭЖХ Основным ограничением газовой хроматографии является возможность анализа только летучих и мало летучих неполярных соединений. Поэтому анализ нелетучих полярных соединений необходимо проводить метод жидкостной хроматографии. Наиболее распространенными классами полютантов, определяемых в объектах морской среды являются: бромированные антипирены, поли арены, перфтороктановая сульфоновая кислота (ПФОС), её соли и т.д. 3

Принцип ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография – наиболее эффективный метод анализа органических проб сложного состава. Процесс анализа пробы делится на 2 этапа анализа : разделение пробы на составляющие компоненты; детектирование и измерение содержания каждого компонента. Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы. Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени. Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделения анализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки. 4

Принцип ВЭЖХ 5

Выбор условий ВЭЖХ с учетом гидрофобности разделяемых веществ 6

Основные виды детекторов ВЭЖХ Наиболее распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микро кювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей максимуму поглощения определяемых веществ. Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра, причем первый вариант используется чаще. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн нм. Принцип действия флюориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ- области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Наиболее важная область их применения - детектирование ароматических полициклических углеводородов. Исключительно информативным является масс-спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Основная проблема, затрудняющая использование этого детектора, проблема ввода потока элюента в масс- спектрометр. Развитие микроколоночной хроматографии позволяет разработать системы прямого ввода потока элюента в ионный источник масс-спектрометра. Используют масс- спектрометры высокого разрешения и достаточного быстродействия с химической ионизацией при атмосферном давлении или ионизацией с применением электро распыления. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000 а.е.м. Масс- спектрометрический детектор предъявляет жесткие требования к чистоте растворителей, является дорогостоящим и сложным в обращении. 7

Методы экстракции СОЗ из твердых образцов Сокслет экстракция (большой расход дорогостоящих растворителей, большие временные затраты) Ультразвуковая экстракция (Низкие степени извлечения) Сверхкритическая флюидная экстракция (Дорогостоящий углекислый газ особой чистоты, уникальное оборудование) Ускоренная жидкостная экстракция (Дорогая установка для экстракции) Микроволновая экстракция (Дорогая установка для экстракции, возможна деградация некоторых ПАУ при экстракции) 8

Схемы определения поллютантов 9 Отбор проб Внесение внутреннего стандарта В случае твердых проб – лиофильное высушивание Экстракция органическими растворителями ВЭЖХ Определение методом ВЭЖХ с спектрофотометрическим, флуорометрическим либо масс-спектрометрическим детекторами Фракционирование методом колоночной хроматографии

Схемы определения ПАУ 10

Пример определения ПАУ в рыбе методом QuEChERS 11

Пример хроматограмм при определения ПАУ в рыбе методом QuEChERS 12