ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ Лекция 3 Клонирование: проблемы и перспективы

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. М.: Мир, с. ГЛАВА 8 htm Чайлахян Л. М, Вепринцев Б. Н., Свиридова Т. А., Никитин В. А. Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

ЧТО ТАКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ? ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

КЛОНИРОВАНИЕ КЛОНИРОВАНИЕ (от древнегреч. κλών «веточка, побег, отпрыск») получение генетически идентичных живых организмов из соматических клеток

ВИДЫ КЛОНИРОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЕ Агамогенез Агамогенез: форма размножения, при которой организм воспроизводит себя самостоятельно, без участия другой особи (одноклеточные, грибы, водоросли, растения, животные) Партеногенез Партеногенез: амейотическая форма (дафнии) ИСКУССТВЕННОЕ Индуцированный партеногенез Индуцированный партеногенез: получения потомства в контролируемых условиях (тутовый шелкопряд, растения) Микроклонирование Микроклонирование растений Транснуклеогенез Транснуклеогенез: перенос ядер соматических клеток с целью терапевтического и/или репродуктивного клонирования (животные)

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ Тотипотентность: способность клетки проходить через все стадии развития и таким образом давать взрослый организм

ИСТОРИЯ МЕТОДА КЛОНИРОВАНИЯ ЖИВОТНЫХ ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

РАЗРАБОТКА КЛЕТОЧНОЙ ТЕОРИИ Маттиас Якоб Шлейден, Теодор Шванн, Рудольф Вирхов

ЭКСПЕРИМЕНТ В. РУ (мозаичной развитие) 1885 г. нескольких дней культивировал нервную пластинку куриного эмбриона 1888 г. попытался с помощью обычной иголки, раскаленной на огне, разделить эмбрион лягушки, состоящий из двух клеток г. нескольких дней культивировал нервную пластинку куриного эмбриона 1888 г. попытался с помощью обычной иголки, раскаленной на огне, разделить эмбрион лягушки, состоящий из двух клеток. Wilhelm Roux ( )

ЭКСПЕРИМЕНТ Х. ДРИША (регуляционное развитие) Ханс Дриш ( ) 1892 г. обнаружил, что при разделении первых двух бластомеров у амфибий и иглокожих каждый из них даёт полноценного зародыша, а затем и личинку, из которой может развиться нормальный взрослый организм 1892 г. обнаружил, что при разделении первых двух бластомеров у амфибий и иглокожих каждый из них даёт полноценного зародыша, а затем и личинку, из которой может развиться нормальный взрослый организм

ЭКСПЕРИМЕНТЫ Х. ШПЕМАНА 1901 г. провел эксперимент с эмбрионом амфибии: разделил его на отдельные клетки и из каждой впоследствии вырастил вполне нормальных головастиков г. провел эксперимент с эмбрионом амфибии: разделил его на отдельные клетки и из каждой впоследствии вырастил вполне нормальных головастиков. Ханс Шпеман ( )

ЭКСПЕРИМЕНТЫ Х. ШПЕМАНА и Г. МАНГОЛЬД 1921 г. открыли явление эмбриональной индукции – взаимодействие элементов развивающегося зародыша, при котором воздействие одного из них направляет (индуцирует) развитие другого 1921 г. открыли явление эмбриональной индукции – взаимодействие элементов развивающегося зародыша, при котором воздействие одного из них направляет (индуцирует) развитие другого а - схема опыта; б - поперечный срез на стадии закладки двух комплексов осевых органов. 1 - спинная губа бластопора; 2 - презумптивная мезодерма; 3 - презумптивная хорда; 4 - материал донора; 5 - инвагинация; 6 - бластоцель; 7 - первичная инвагинация; 8 - вторичная инвагинация; 9 - хорда; 10 - нервная трубка; 11 - мезодерма; 12 - полость кишки; 13 - энтодерма

ЭКСПЕРИМЕНТ Г.В. ЛОПАШЕВА Георгий Викторович Лопашов ( ) 1948 г. разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки 1948 г. разработал метод трансплантации ядер в яйцеклетку лягушки

ЭКСПЕРИМЕНТ Р. БРИГГСА и Т. КИНГА Роберт Бриггс и Томас Кинг ( ) ( ) 1952 г. повторили и усовершенствовали метод трансплантации ядер 1952 г. повторили и усовершенствовали метод трансплантации ядер

ЭКСПЕРИМЕНТ Дж. ГЕРДОНА Джон Гёрдон (1933) 1962 г. использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства е гг. разработал метод серийных пересадок 1962 г. использовал в качестве донора ядер специализировавшиеся клетки эпителия кишечника головастика. Выживало не более двух процентов клонированного потомства е гг. разработал метод серийных пересадок

ЭКСПЕРИМЕНТ К. ИЛЛМЕНСЕЕ и П. ХОППЕ 1982 г. получили серых мышат, перенеся ядра клеток серого зародыша в цитоплазму яйцеклетки, полученной от черной самки, после чего эмбрионы были перенесены в белых самок, которые и выносили потомство. Результаты не были воспроизведены в других лабораториях, Иллменсее обвиненили в фальсификации г. получили серых мышат, перенеся ядра клеток серого зародыша в цитоплазму яйцеклетки, полученной от черной самки, после чего эмбрионы были перенесены в белых самок, которые и выносили потомство. Результаты не были воспроизведены в других лабораториях, Иллменсее обвиненили в фальсификации. Питер Хоппе ( ) Карл Иллменсее (1939)

ЭКСПЕРИМЕНТ Л.М. ЧАЙЛАХЯНА и сотрут г. первое клонирование млекопитающих (лабораторная линия мышей-альбиносов CBWA ) 1987 г. первое клонирование млекопитающих (лабораторная линия мышей-альбиносов CBWA ) Мышку клонировали из невзрачной тушки, которая 16 лет провела в холодильнике Чайлахян Л.М, Вепренцев Б.Н., Свиридова Т.А., Никитин В.А. Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии //Биофизика, 1987

ЭКСПЕРИМЕНТ Я. УИЛМУТА Ян Уилмут Долли (1944) ( ) Билл Ритчи Карен Майкок Кейт Кэмпбэлл ( )

ЭКСПЕРИМЕНТ Р. ЯНАГИМАЧИ и сотрут. усовершенствование метода переноса ядра: изобрели микропипетку, с помощью которой можно было безболезненно извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в энуклеированную яйцеклетку. Риузо Янагимачи

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ КЛОНИРОВАНИЯ ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

ПРОБЛЕМЫ ПРОБЛЕМА ПЕРЕСАДКИ ЯДЕР ПРОБЛЕМА РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ЯДРА И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ ГЕНОМА ПРОБЛЕМА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕПРОДУКТИВНОГО КЛОНИРОВАНИЯ

МЕТОДЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ЯДЕР ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

ОСНОВНЫЕ МЕОТДЫ МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ (использование микропипеток) ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (использование химических веществ, например цитохалазина В) ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (электростимуляция)

МИКРОМАНИПУЛЯЦИЯ 1. тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы 2.пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора 1. тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы 2.пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора

ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИЯ 1. первый разряд – для слияния клеток 2. второй – для стимуляции механизма дробления 1. первый разряд – для слияния клеток 2. второй – для стимуляции механизма дробления

ХИМИЧЕСКОЕ СЛИЯНИЕ Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Кариопластов выделяют через ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Кариопластов выделяют через ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. цитохалазин В центрифугирование получение цито пластов и кариопластов

ПОСЛЕДСТВИЯ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ЯДРА И РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ ГЕНОМА ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНОТИПА В ФЕНОТИП

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ наследование особенностей экспрессии генов

ПРИМЕРЫ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ЯВЛЕНИЙ Метилирование ДНК в области промотора гена: наследование окраски мышей Случайная инактивация одной из Х-хромосом Случайная инактивация одной из Х-хромосом

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Посттранскрипционная модификация гистонов АТФ-зависимый ремоделлинг хроматина мРНК Посттранскрипционная модификация гистонов АТФ-зависимый ремоделлинг хроматина мРНК

ПОСЛЕДСТВИЯ НАРУШЕНИЕ ПРОЦЕССА МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ДИСРЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ НАРУШЕНИЕ «ГИСТОНОВОГО КОДА» КОМПАКТИЗАЦИЯ ДНК

ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ ГИСТОНОВ Зеленый – метилирование лизина и аргинина Желтый Желтый – фосфорилирование серина и треонина Красный – ацетилирование лизина Синий – убиквитинирирование лизина Зеленый – метилирование лизина и аргинина Желтый Желтый – фосфорилирование серина и треонина Красный – ацетилирование лизина Синий – убиквитинирирование лизина

КАК РАБОТАЕТ ГИСТОНОВЫЙ КОД

ИЗМЕНЕНИЕ СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ мРНК

СИНДРОМ РЕТТА доминантное сцепленное с Х-хромосомой постнатальное нарушение развития и нервной системы

ФОРМЫ КЛОНИРОВАНИЯ ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

ФОРМЫ МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ получение клонов генов на основе техники рекомбинантных ДНК

РЕПРОДУКТИВНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ создание точной копии организма с использованием его генетического материала

ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ получения клеточных культур – трансплантатов 1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) 2. Зигота делится надвое 3-4. Митотическое деление продолжается 5. Через 5-6 дней образуется бластоциста 6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ) помещают на питательную среду для получения стволовых клеток

ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ ОСНОВЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИЯ. КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНИРОВАНИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ.

ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ терапевтического клонирования ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

ПЕРСПЕКТИВЫ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ репродуктивного клонирования ПЕРСПЕКТИВЫ КОНИРОВАНИЕ ИСЧЕЗАЮЩИХ И ВЫМЕРШИХ ВИДОВ РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПЕРВИЧНОГО БЕСПЛОДИЯ КОММЕРЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ