ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ Лекция 5

Перспективы развития генетической инженерии 1 Получение ДНК зондов для исследования структуры и функций и экспрессии генов 2 Дальнейшее развитие «обратной генетики»: зная белок, выделяют и модифицируют, кодирующий его ген, и получают белок с новыми свойствами 3 Развитие и совершенствование генной терапии: методологии лечения наследственных болезней 4 Получение ГМО, трансгенных растений и животных с полезными для человека свойствами

РЕКОМБИНАЦИЯ ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

Рекомбинация – процесс реорганизации генома, обмен участками ДНК Словарь

Виды рекомбинационных событий Перетасовка хромосом в мейозе Случайный характер слияния гамет при оплодотворении Обмен фрагментами между гомологичными хромосомами

Классификация рекомбинационных явлений Основана на спаривании комплементарных цепей ДНКОснована на спаривании комплементарных цепей ДНК Требуется общая (по всей длине молекулы) гомология между рекомбинирующими участками Требуется общая (по всей длине молекулы) гомология между рекомбинирующими участками Гомологичная (общая, кроссинговер) Происходит между последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно п.н.Происходит между последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно п.н. Сайт- специфическая это сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНКэто сборная группа процессов, где рекомбинация происходит без гомологии между молекулами ДНК Незаконная

Схема сайт-специфической рекомбинации бактериофага лямбда А) линейная (вирионная) ДНК фага Б) ДНК фага после инфекции в E. coli замыкается в кольцо, и находящийся в ней сайт attP вступает в рекомбинацию с сайтом attB в хромосоме бактерии В) продукт рекомбинации - профаг в составе хромосомы бактерии Г) запись процесса рекомбинации в общем виде А) линейная (вирионная) ДНК фага Б) ДНК фага после инфекции в E. coli замыкается в кольцо, и находящийся в ней сайт attP вступает в рекомбинацию с сайтом attB в хромосоме бактерии В) продукт рекомбинации - профаг в составе хромосомы бактерии Г) запись процесса рекомбинации в общем виде

РЕКОМБИНОГЕНЕЗ ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

позволяет кардинально изменять живые организмы на генетическом уровне, вплоть до создания новых видов с новыми заданными свойствами СОВРЕМЕННЫЕСОВРЕМЕННЫЕ РЕКОМБИНОГЕНЕЗ Клеточная инженерия культивирование гибридизация реконструкция Клеточная инженерия культивирование гибридизация реконструкция Генетическая инженерия метод рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование Генетическая инженерия метод рекомбинантных ДНК или молекулярное клонирование Методы селекции Белковая инженерия рациональный дизайн направленная эволюция Белковая инженерия рациональный дизайн направленная эволюция

Открытие явления трансформации 1928 г. открытие явления трансформации 1928 г. открытие явления трансформации Фредерик Гриффит Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae – пневмококки. Бактерии, вызывающие пневмонию. 1. Капсульный S-штамм – патогенный 2. Бескапсульный R-штамм – непатогенный Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae – пневмококки. Бактерии, вызывающие пневмонию. 1. Капсульный S-штамм – патогенный 2. Бескапсульный R-штамм – непатогенный

Метод создания новых генетических программ путем конструирования и внесения новой генетической информации в уже существующие живые организмы Генетическая инженерия или молекулярное клонирование

Berg, Paul (США) (р. 1926) Нобелевская премия по химии, 1980 Историяметода г. – появление методологии Пол Берг сконструировал rДНК из фрагмента ДНК вируса SV40, бактериофага λ и оперона E. Coli г. – появление методологии Пол Берг сконструировал rДНК из фрагмента ДНК вируса SV40, бактериофага λ и оперона E. Coli

1972 г. Анни Чанг 1972 г. Анни Чанг Герберт Бойер Герберт Бойер Поль Берг Поль Берг Стенли Коэн Стенли Коэн рекомбинантную ДНК установили, что при помощи ферментов рестриктаз можно порезать две любые молекулы ДНК и сделать из них одну рекомбинантную ДНК 1972 г. Анни Чанг 1972 г. Анни Чанг Герберт Бойер Герберт Бойер Поль Берг Поль Берг Стенли Коэн Стенли Коэн рекомбинантную ДНК установили, что при помощи ферментов рестриктаз можно порезать две любые молекулы ДНК и сделать из них одну рекомбинантную ДНК Поль Берг Стенли Коэн Герберт Бойер Анни Чанг

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФЕРМЕНТОВ ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

«Генетическая инженерия – потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты» З.И.Абрамова «Генетическая инженерия – потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты» З.И.Абрамова

Рестриктазы (1962 г. В. Арбер) Фрагментируют молекулы ДНК, внося разрывы путем гидролиза обеих цепей ДНК Ревертазы (1970 г. Г. Темин) Синтезируют ДНК на матрице РНК ДНК-полимеразы (1958 г. А. Корнберг) Синтезируют ДНК на матрице ДНК ДНК-лигазы (1967 г. М. Геллерт) Лигируют фрагменты ДНК за счет формирования фосфодиэфирных связей между нуклеотидами Терминальные трансферазы (1962 г. Боллум) Достраивают к концам двойной спирали ДНК к одной из нитей пуриновые, а к другой пиримидиновые нуклеотиды Эндонуклеазы бактериофага (1975 г. Грей) Отщепляют 3-концы двойной спирали ДНК

Суть метода

Рекомбинантная ДНК – искусственно сконструированная ДНК, несущая фрагменты генетической информации разных организмов Трансгенез – процесс перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспрессии Векторы – системы доставки трансгена, обеспечивающие его интеграцию, амплификацию и экспрессию Рекомбинантная ДНК – искусственно сконструированная ДНК, несущая фрагменты генетической информации разных организмов Трансгенез – процесс перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспрессии Векторы – системы доставки трансгена, обеспечивающие его интеграцию, амплификацию и экспрессию Словарь

I этап Получение гена II этап Создание рекомбинантной ДНК III этап Создание трансгенного организма IV этап Отбор модифицированных систем ТЕХНИКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

I ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНА ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена Цель: получение гена-матрицы для молекулярного клонирования Цель: получение гена-матрицы для молекулярного клонирования Методы: 1) рестриктазный 2) химико-ферментативный синтез 3) синтез на основе мРНК Методы: 1) рестриктазный 2) химико-ферментативный синтез 3) синтез на основе мРНК

Рестриктазы Рестриктазы – ферменты, узнающие особые последовательности нуклеотидов в ДНК (сайты рестрикции)

1 тип узнают сайт рестрикции и вносят разрез неподалёку, в произвольной точке узнают сайт рестрикции и вносят разрез неподалёку, в произвольной точке 2 тип 2 тип узнают сайт рестрикции и вносят разрез в фиксированной точке внутри сайта узнают сайт рестрикции и вносят разрез в фиксированной точке внутри сайта 3 тип 3 тип узнают сайт рестрикции и вносят разрез отступив на несколько нуклеотидов от конца сайта узнают сайт рестрикции и вносят разрез отступив на несколько нуклеотидов от конца сайта Рестриктазы. Типы рестрикции.

Химико-ферментативный синтез гена Разработан X. Кораной 1)хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов 2) соединение (лигирование) олигонуклеотидов с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Разработан X. Кораной 1)хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонуклеотидов 2) соединение (лигирование) олигонуклеотидов с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы.

ДНК экзонинтронэкзон интрон Транскрипция РНК первичный транскрипт Сплайсинг Матричная РНК Обратная транскрипция Клональная ДНК Синтез на основе мРНК

II ЭТАП. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена II этап Создание рекомбинантной ДНК Цель: внесение гена-матрицы (трансгена) в вектор Цель: внесение гена-матрицы (трансгена) в вектор

ВЕКТОРА ВЕКТОРА (лат. vector – несущий) молекулы способные к самостоятельной репликации и обеспечивающие интеграцию, амплификацию и экспрессию трансгена

Словарь Амплификация – увеличение количества копий rДНК (трансген + вектор) Интеграция – встраивание rДНК в ДНК хозяина Экспрессия – транскрипция трансгена аппаратом клетки хозяина Амплификация – увеличение количества копий rДНК (трансген + вектор) Интеграция – встраивание rДНК в ДНК хозяина Экспрессия – транскрипция трансгена аппаратом клетки хозяина

Требования к векторным молекулам Нести сайты рестрикции в участках, не влияющих на репликацию Иметь специфические и сильные промоторы транскрипции, а также терминаторы Быть способными к автономной репликации Содержать специфические маркеры

Классификация векторов по реципиентным системам Естественные плазмиды бактериофаги Естественные плазмиды бактериофаги Искусственные космиды фазмиды бакмиды Искусственные космиды фазмиды бакмиды Естественные плазмиды вирусы Естественные плазмиды вирусы Искусственные челночные векторы Вектора прокариот Вектора эукариот

Словарь Бакмиды – челночные векторы на основе генома бакуловируса, способные существовать в клетках E.coli Космиды – плазмидные векторы, в ко­торые встроен участок генома фага λ, обеспечи­вающий возможность упаковки молекулы в фаговую частицу Фазмиды – векторы, которые содержат генетические элементы плазмид и бактериофагов Бакмиды – челночные векторы на основе генома бакуловируса, способные существовать в клетках E.coli Космиды – плазмидные векторы, в ко­торые встроен участок генома фага λ, обеспечи­вающий возможность упаковки молекулы в фаговую частицу Фазмиды – векторы, которые содержат генетические элементы плазмид и бактериофагов

Классификация векторов по функциям вектора, обеспечивающие репликацию гибридной молекулы в клетке вектора, обеспечивающие правильную и эффективную экспрессию чужеродной ДНК в клетке-реципиенте вектора, обеспечивающие интеграцию чужеродной ДНК в геном реципиента

I этап Получение гена II этап Создание рекомбинантной ДНК Методы введения гена в вектор: рестриктазно-лигазный коннекторный Методы введения гена в вектор: рестриктазно-лигазный коннекторный

Применим для гена и вектора с комплементарными «липкими» концами Рестриктазо-лигазный метод

Впервые был применен С. Коэном в 1973 году. Рестриктазы, вносят в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образуют "ступеньку" Впервые был применен С. Коэном в 1973 году. Рестриктазы, вносят в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образуют "ступеньку" Рестриктазо-лигазный метод

/

Применим для гена и вектора с некомплементарными «тупыми» концами Коннекторный метод Впервые был выполнен в 1972 году П.Бергом. Экзонуклеаза отрезает «тупые» концы Терминальная трансфераза пришивает линкерные молекулы к 3-концам фрагментов ДНК вектора достраивают одноцепочечные олиго (dA)-сегменты, а к 3-концам фрагмента трансгена олиго (dT)-сегменты линкеры соединяются за счет комплементарности (dА)- и (dT)- последовательностей Впервые был выполнен в 1972 году П.Бергом. Экзонуклеаза отрезает «тупые» концы Терминальная трансфераза пришивает линкерные молекулы к 3-концам фрагментов ДНК вектора достраивают одноцепочечные олиго (dA)-сегменты, а к 3-концам фрагмента трансгена олиго (dT)-сегменты линкеры соединяются за счет комплементарности (dА)- и (dT)- последовательностей

III ЭТАП. СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННОГО ОРГАНИЗМА ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

I этап Получение гена II этап Создание рекомбинантной ДНК III этап Создание трансгенного организма Цель: введение гена-матрицы в организм-реципиент Цель: введение гена-матрицы в организм-реципиент Методы введения рДНК в клетку: конъюгация трансдукция трансфекция трансформация Методы введения рДНК в клетку: конъюгация трансдукция трансфекция трансформация

Конъюгация Трансдукция Трансфекция Трансформация Методы введения рДНК в клетку-реципиент

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансдукция (вектор с элементами генома бактериофага)

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансфекция (вектор с элементами генома вируса)

Методы введения rДНК в клетку-реципиент коньюгация (вектор с элементами генома плазмид)

Методы введения rДНК в клетку-реципиент трансформация (при физиологической некомпетентности) микроиньекция электропорация липофекция биобаллистика

IV ЭТАП. ОТБОР ТРАНСГЕНЕЗ. МИКРООРГАНИЗМЫ. Лекция 5

53 I этап Получение гена II этап Создание рекомбинантной ДНК III этап Создание трансгенного организма IV этап Отбор модифицированных систем Цель: оценка результата молекулярного клонирования Цель: оценка результата молекулярного клонирования Методы: маркерный, иммунологическая детекция, скрининг, картирование, секвенирование Методы: маркерный, иммунологическая детекция, скрининг, картирование, секвенирование

Методы отбора

а) Применение репортерных (маркерных) генов первого, второго и третьего поколений: - NPT-ген (неомицинфосфотрансфераза и других антибиотикоустойчивых генов) - GUS-ген (глюкуронидаза) - GFP-ген (greenfluorescenceprotein) б) Селекция клеток на средах с антибиотиками в) Обнаружение продуктов экспрессии репортерных генов и/или их активности Отбор по векторам Селективные, репортерные маркеры Селективные, репортерные маркеры

верхнем правом углу много мелких названий – это перечислены сайты рестрикции Rep – это участок отвечающий за репликацию (размножение) плазмиды в клетке Amp – репортерный ген устойчивости к антибиотику – ампициллину

Отбор по векторам Устойчивость к антибиотику Устойчивость к антибиотику

Отбор по векторам. GFP GFP

Отбор по трансгену блот-анализа по Саузерену блот-анализа по Саузерену 1. Синтезируют меченые нуклеотиды (ДНК зонды) 2. Фрагмент целевой ДНК переводят на нитроцеллюлозный фильтр. 3. Связавшиеся молекулы ДНК обрабатывают щелочным раствором, в результате одна нить ДНК «отрывается» от другой. 4. На фильтр наносят раствор с ДНК-зондом, комплементарные участки совпадают, происходит гибридизация. 5. Сканируют фильтр

Первые достижения ИНСУЛИНИНТЕРФЕРОНСОМАТОТРОПИН

Гипофизарная карликовость