ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ. МУТАГЕНЕЗ Лекция 4

«Селекция – это эволюция, направляемая волей человека» Н.И. Вавилов «Селекция – это эволюция, направляемая волей человека» Н.И. Вавилов

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ. МУТАГЕНЕЗ Лекция 4

Аутбридинг – скрещивание или система скрещиваний неродственных форм одного вида Гибридизация – процесс получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной Гибриды – потомство, полученное от скрещивания генетически различных родительских форм Инбридинг – близкородственное скрещивание, скрещивание организмов, имеющих общих предков Полиплоиды – кратное гаплоидному увеличение числа хромосом Аутбридинг – скрещивание или система скрещиваний неродственных форм одного вида Гибридизация – процесс получения гибридов, в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной Гибриды – потомство, полученное от скрещивания генетически различных родительских форм Инбридинг – близкородственное скрещивание, скрещивание организмов, имеющих общих предков Полиплоиды – кратное гаплоидному увеличение числа хромосом Словарь

Подбор родительских пар Традиционные методы селекции высших организмов Гибридизация Гибридизация Отбор Отбор Получение полиплоидов Испытание по потомству аутбридинг инбридинг массовый индивидуальный

Метод Селекция животных Селекция растений Подбор родительских пар По ценным признакам и по экстерьеру По месту происхождения (географически удаленных) или генетически отдаленных (неродственных) Традиционные методы селекции высших организмов

Метод Селекция животных Селекция растений Гибридизация неродственная (аутбридинг) Скрещивание отдаленных пород, для получения гетерозиготных популяций и проявления гетерозиса. Потомство бесплодное Внутривидовое, межвидовое, межродовое скрещивание, ведущее к гетерозису, для получения гетерозиготных популяций Мулы – кросс между ослом и кобылицей shtml Традиционные методы селекции высших организмов

Метод Селекция животных Селекция растений Гибридизация близкородственная (инбридинг) Скрещивание между близкими родственниками для получения гомозиготных (чистых) линий Самоопыление у перекрестноопыляю вьювьющихся растений для получения гомозиготных (чистых) линий Традиционные методы селекции высших организмов

Метод Селекция животных Селекция растений Отбор: массовый Не применяется Применяется в отношении перекрестноопыляю вьювьющихся растений Отбор:индивидуальный Жесткий отбор по хозяйственно ценным признакам, выносливости, экстерьеру Применяется в отношении самоопыляювьювьющихся растений, выделяются чистые линии Традиционные методы селекции высших организмов

Метод Селекция животных Селекция растений Гибридизация: а) неродственная (аутбридинг) Скрещивание отдаленных пород, для получения гетерозиготных популяций и проявления гетерозиса. Потомство бесплодное Внутривидовое, межвидовое, межродовое скрещивание, ведущее к гетерозису, для получения гетерозиготных популяций Традиционные методы селекции высших организмов

Методы Селекция животных Селекция растений Метод испытания производителей по потомству Искусственное осеменение от лучших производителей, качества которых проверяют по многочисленному потомству Не применяется Традиционные методы селекции высших организмов

Методы Селекция животных Селекция растений Экспериментальное получение полиплоидов Не применяется Применяется для получения более продуктивных, урожайных форм Традиционные методы селекции высших организмов

Традиционные методы селекции микроорганизмов Мутагенез Мутагенез Отбор Отбор спонтанный Геном - гаплоидный Половое размножение - нет

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ. МУТАГЕНЕЗ. Лекция 4

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙМУТАГЕНЕЗ ИНДУЦИРОВАННЫЙРЕКОМБИНОГЕНЕЗ искусственное изменение наследственного материала с целью получения мутаций Модификация признака. Метод применим при условии наличия признака в геноме искусственное перемещение фрагментов генома или компонентов клеток Внедрение нового признака Метод позволяет вносить принципиально новые признаки Современные методы селекции генная клеточная белковая спонтанный индуцированный

МУТАГЕНЕЗ В СЕЛЕКЦИИ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ. МУТАГЕНЕЗ. Лекция 4

Структурные (кодирующие) гены – несут информацию о белках и последовательности нуклеотидов в РНК Регуляторные (функциональные) гены – регулируют и модулируют экспрессию структурных генов Структурные (кодирующие) гены – несут информацию о белках и последовательности нуклеотидов в РНК Регуляторные (функциональные) гены – регулируют и модулируют экспрессию структурных генов Словарь

Структурные гены

Транскриптоны

Структурные и регуляторные гены

Регуляторные гены ГЕНЫ- РЕГУЛЯТОРЫ регулируют работу структурных генов ПРОЦЕССИНГ ГЕНЫ регулируют посттранскрипционный и посттрансляционный процессинг ТЕМПОРАЛЬНЫЕ ГЕНЫ включают в работу структурные гены в ходе клеточной дифференцировки

МУТАГЕНЕЗ В СЕЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ. МУТАГЕНЕЗ. Лекция 4

Требования к микроорганизмам- промышленным продуцентам Обладать высокой скоростью прироста биомассы и давать высокий выход целевого продукта при минимальных сырьевых затратах Проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов Быть конкурентными по отношению к другой микрофлоре и устойчивыми к вирусным инфекциям Расти на дешевых и доступных субстратах Быть безвредными для людей и окружающей среды

Мутации, приводящие к сверхсинтезу Мутации в структурных и регуляторных генах Изменяют скорость поглощения и утилизации субстрата клеткой Изменяют уровень синтеза биосинтетических ферментов и активность регуляторных ферментов Изменяют регуляцию дальнейшего внутриклеточного превращения продукта или его деградации Изменяют способность к экскреции продукта из клетки

1-глюкокиназа, 2 - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа фосфоглюконатдегидро-геназа кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза 5 - дегидрогеназа 3-фосфо-глицеринового альдегида 6 - фосфоглицераткиназа 7- фосфоглицеромутаза 8 - енолаза, 9 - пируваткиназа, 10 - фруктокиназа, 11 - фосфогексоизомераза 12 - левансахараза, 13 - глюконокиназа, 14 - глюкозофруктозотрансгидрогеназа Мутанты бактерий Zymomonas mobilis с нарушенной функцией фермента фруктокиназы не ассимилируют фруктозу. После расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу мутанты ассимилируют только глюкозу, а фруктоза пассивно накапливается в среде. Мутанты бактерий Zymomonas mobilis с нарушенной функцией фермента фруктокиназы не ассимилируют фруктозу. После расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу мутанты ассимилируют только глюкозу, а фруктоза пассивно накапливается в среде. Схема катаболизма у Zymomonas mobili

Стадии I.Подготовительнаястадия I. Подготовительная стадия II. Стадия культивирования III. Стадия получения продукта Биотехнологический процесс

Основные этапы подготовительной стадии

Упрощенная схема селекции микроорганизмов

1. Выбор биообъекта 1. Выбор биообъекта (поиск исходных «диких» структур, отбор наиболее перспективного материала для селекции) Подготовительная стадия (объект селекции - микроорганизмы)

Выбор биообъекта для последующей селекции А) Поиск диких форм ИСТОЧНИКИ музейные культуры известные промышленные продуценты природные субстраты

Выбор биообъекта для последующей селекции Б) Отбор наиболее перспективного материала ПРИНЦИПЫ Знания (особенностей генетической организации и метаболизма)Знания Наблюдение (способность к избыточному синтезу )Наблюдение Эксперимент (введение легко тестируемых мутаций)Эксперимент

Подготовительная стадия (объект селекции - микроорганизмы) Подготовка биообъекта к селекционной работе 2. Подготовка биообъекта к селекционной работе (получение генетически однородных форм для последующей селекции, стабилизация биообъектов по качественным и количественным характеристикам)

Подготовка биообъекта к селекционной работе А) Получение «чистых культур» Получение накопительных культур Внесение в элективные питательные среды Пересев на твердые питательные среды Получение «чистых культур» Р.Кох

Подготовка биообъекта к селекционной работе Б) Стабилизация биообъектов Чистка культуры «Чистка культуры» - выявление типичной морфологической формы и отклонений от нее. Оценка продуктивности, как основной морфологической формы, так и ее вариантов. Ступенчатое клонирование «Ступенчатое клонирование» - проверка стабильности выбранного клона по количественному признаку, то есть продуктивности.

3. Селекция биообъектов 3. Селекция биообъектов (выбор метода селекции: мутагенез или рекомбиногенез, селекция биообъектов, отбор и стабилизация биообъектов по приобретенным свойствам) Подготовительная стадия (объект селекции - микроорганизмы)

Микроорганизмы как объект селекции имеют ряд особенностей: имеют ряд особенностей: «-» Высокие темпы мутирования. «-» Высокие темпы мутирования. Генетическая однородность микробной колонии быстро нарушается (высокие темпы деления естественные мутации). «-»Гаплоидность «-» Гаплоидность микроорганизмов ограничивает комбинативную изменчивость – основу селекции высших организмов. «+»Быстрая смена поколений «+» Быстрая смена поколений обеспечивает их перспективность при отборе положительных экземпляров и для быстрой оценки результатов селекционной работы. Микроорганизмы как объект селекции имеют ряд особенностей: имеют ряд особенностей: «-» Высокие темпы мутирования. «-» Высокие темпы мутирования. Генетическая однородность микробной колонии быстро нарушается (высокие темпы деления естественные мутации). «-»Гаплоидность «-» Гаплоидность микроорганизмов ограничивает комбинативную изменчивость – основу селекции высших организмов. «+»Быстрая смена поколений «+» Быстрая смена поколений обеспечивает их перспективность при отборе положительных экземпляров и для быстрой оценки результатов селекционной работы.

А) Выбор метода селекции ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП организм несет признак ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП организм несет признак ДАНЕТ мутагенез рекомбиногенез

СОВРЕМЕННЫЕСОВРЕМЕННЫЕ Мутагенез применяется для улучшения свойств, присущих данной живой системе, с применением прямых или непрямых мутагенов. МУТАГЕНЕЗ Спонтанный Индуцированный

Мутагенез – процесс внесения изменений в структуру генома под действием мутагенных факторов Мутагены – факторы, вызывающие повреждение структуры ДНК Мутации – перестройки генетического материала Ауксотрофы – микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из веществ, необходимых для их роста (аминокислоту, витамин или др.). Мутагенез – процесс внесения изменений в структуру генома под действием мутагенных факторов Мутагены – факторы, вызывающие повреждение структуры ДНК Мутации – перестройки генетического материала Ауксотрофы – микроорганизмы, утратившие способность синтезировать одно из веществ, необходимых для их роста (аминокислоту, витамин или др.).Словарь

Физические Химические Биологические температура,излучения быстрые электроны, протоны, нейтроны, α-частицы, рентгеновские, γ-лучиультразвуктемпература,излучения быстрые электроны, протоны, нейтроны, α-частицы, рентгеновские, γ-лучиультразвук ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот нуклеиновых кислот: аналоги азотистых оснований кофеин, азагуанидин, аминоурацил, аминопурин аналоги азотистых оснований: 5-бромурацил, 5-хлорурацил алкилирующие соединения алкилирующие соединения: формальдегид, фенол, диметилсульфат супермутагены производные нитрозосоединений ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот нуклеиновых кислот: аналоги азотистых оснований кофеин, азагуанидин, аминоурацил, аминопурин аналоги азотистых оснований: 5-бромурацил, 5-хлорурацил алкилирующие соединения алкилирующие соединения: формальдегид, фенол, диметилсульфат супермутагены производные нитрозосоединений бактериофаги, биотоксины грибов биотоксины грибов: афлатоксин В1 экзогенная ДНК экзогенная ДНК вирусыбактериофаги, биотоксины грибов биотоксины грибов: афлатоксин В1 экзогенная ДНК экзогенная ДНК вирусы Мутагенные факторы

1. Апуринизация Механизмы индукции мутаций в ДНК Мутаген - температура Разрывается N-гликозидная связь между пуриновым основанием и дезоксирибозой.

2. Дезаминирование Механизмы индукции мутаций в ДНК Мутаген - излучения Аденин гипоксантин Гуанин ксантин цитозинаурацил Аденин превращается в гипоксантин, который может связываться с цитозином. Гуанин превращается в ксантин, который связывается с тимином. Из цитозина образуется урацил.

3. Тиминовые димеры Механизмы индукции мутаций в ДНК ультрафиолет Сшиваются соседние пиримидины. Это блокирует репликацию. Сшиваются соседние пиримидины. Это блокирует репликацию.

а - тиминовый димер циклобутанового типа б - пиримидиновый димер

Для эффективной индукции мутаций необходимо учитывать Для эффективной индукции мутаций необходимо учитывать : характер биологического материала характермутагенного воздействия характер мутагенного воздействия способпрекращения мутагенноговоздействия способ прекращения мутагенного воздействия дозумутагенного воздействия дозу мутагенного воздействия

Методы отбора мутантов Скрининг Отбор по фенотипу Проводят количественную оценку нового признака/ свойства тотально у всех подвергнутых мутагенному воздействию организмов. При отборе учитывают фенотипические особенности организма, возникающие под действием мутации: ауксотрофность, резистентность и др.