1 Лекция 3: Репарация мтДНК

2 За день в каждой клетке человека происходит повреждений ДНК. В человеческом организме около ~10 13 клеток. За сутки каждый из нас получает ~10 17 повреждений ДНК.

3 С возрастом частота мутаций в мтДНК увеличивается примерно в 5 раз к 80 ти годам. PMID:

4 МтДНК мутирует быстрее ядерной Почему? в митохондриях повышенное содержание ROS в митохондриях более слабый аппарат репарации в митохондриях менее точный аппарат репликации

5 В нормальной человеческой клетке: oxoG/10 6 G, что соответствует 7.7 х 10 4 – 1 х oxoG в одной клетке Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8 охот и 8 охоА

6 Частота трансверсии G ->T практически не увеличивается с возрастом также как и все остальные трансверсий, в отличии от транзиций. Транзиция одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое (аденин на гуанин или наоборот), либо происходит аналогичная перестановка пиримидиновых оснований (тимин с цитозином).аденин гуанин тимин цитозином Трансверсия пуриновое основание замещается на пиримидиновое основание или наоборот. Частота разных типов мутаций в мтДНК PMID:

7 Количество мутаций в мтДНК увеличивается с возрастом не за счет образования 8 охот под действием окислительного стресса.

8 В области D-loop мутаций больше, чем в остальном геноме. Но относительное количество каждого типа мутаций одинаково по всему мт геному и не меняется с возрастом. Видимо, уже при рождении мутаций в D-loop больше. Как распределены мутации по мт геному?

9 Замены G ->A и Т ->С чаще происходят в L-цепи, чем в Н-цепи по всему мт-геному, но не D-loop. Как распределяются мутации по цепям мт ДНК?

10 Это можно объяснить асинхронной репликацией мтДНК: материнская Н-цепь остается в ос состоянии, когда с oriH идет синтез Н-цепи на матрице L-цепи. В односепочечном состоянии в Н-цепи происходит спонтанное дезаминирование цитозина с образованием тимина и аденина с образованием гуанина.

11 За счет чего растет частота мутаций в митохондриях? Возникает спонтанное дезаминирование С и А особенно в односепочеченых участках ДНК в ходе репликации ДНК полимераза γ ошибается в репликации Возможно, 8 охот удаляется до репликации или его репарация усиливается с возрастом

12 Виды репарации Изменение в одной цепи ДНК: 1. BER – base excision repair: замена измененного в результате окисления, алкилирования, гидролиза или дезаминирования азотистого основания 2. MMR – mismatch repair: удаление неспаренных нуклеотидов 3. NER – nucleotide excision repair: исправление нарушений правильной двухцепочечной структуры ДНК (например, пиримидиновых димеров)

13 1. NHEJ – non- homologous end joining: DNA ligase IV использует ближайшие выступающие концы ДНК для присоединения к месту разрыва и его сшивания. Этот просесс приводит к серьезным нарушениям в геноме 2. HR – homologous recombination: для восстановления структуры ДНК в качестве матрицы используются гомологичные хромосомы Изменения в обеих цепях ДНК (Double-strand break repair):

14 PMID:

15 Репарация митохондриальной ДНК. BER – base excision repair MMR – mismatch repair NER – nucleotide excision repair NHEJ – non- homologous end joining HR – homologous recombination PMID:

16 Base excision repair (BER) в митохондриях: SN (single nucleotide) or SP (short patch) BER – заменяется 1 нуклеотид LP (long patch) BER – заменяется 2-6 нуклеотидов

17 1. Специфичная ДНК- гликозилаза перемещает поврежденное основание ДНК 2.АP-эндонуклеаза (от apurinic or apyrimidinic site) расщепляет цепь ДНК, оставляя единичный разрыв, содержащий 5-dRP- группу. 3. Вместо удаленного нуклеотида ДНК- полимераза вставляет новый (ые). 4. Лигаза зашивает цепь ДНК. Base excision repair (BER) в митохондриях: PMID:

18 SN BER: 5-dRP- группа удаляется, а gap заполняет DNA pol γ, затем сшивает DNA ligase III Скорость dRP-лиазной реакции у DNA pol γ ниже, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре. LP BER проходит в экстрактах митохондрий в присутствии белков: Хеликаза DNA2 просессирует расширяющуюся flap-структуру Flap endonuclease FEN1 удаляет flap-структуру, замененную DNA pol γ Ligase III сшивает разрыв

19 Основные виды повреждений азотистых оснований: Окисление Алкилирование Дезаминирование

20 Base excision repair (BER) в митохондриях: Поврежденные азотистые основания удаляются специфичными гликозилазами

21 Основные продукты окисления азотистых оснований

22 В нормальной человеческой клетке: oxoG/10 6 G, что соответствует 7.7 х 10 4 – 1 х oxoG в одной клетке Наиболее распространенные продукты окислительного стресса: 8 охот и 8 охоА

23 Репарацию 8oxoG осуществляет гликозилаза OGG1 (MutM у бактерий). Альтернативный сплайсинг мРНК hOGG1 дает несколько лизоформ фермента, в том числе и митохондриальную. В ядре есть другие ферменты для репарации 8oxoG, в митохондрии их нет: В экстрактах митохондрий из ogg1-/- мышей in vitro не вырезается 8oxoG. У ogg1-/- мышей в ядре содержание 8oxoG увеличивается не сильно, в митохондриях гораздо сильнее. MYH (MutY у бактерий) перемещает аденин или гуанин, ошибочно вставленные при репликации во вторую цепь ДНК напротив 8oxoG. Альтернативный сплайсинг дает ядерную и митохондриальную лизоформы MYH.

24 Образование тимингликоля из тимина под действием окислительного стресса блокирует работу РНК- и ДНК- полимеразы

25 Тимингликоль удаляется тимингликоль- гликозилазой. У дрожжей её кодируют два гена: NTG1 и NTG2. У NTG1 двойная локализация – в ядре и в митохондриях, а NTG2 образует ядерную лизо форму. PMID:

26 Совместно с NTG1 в дрожжевых митохондриях при BER- репарации работает хеликаза PIF1. Совместное потеря генов NTG1, PIF1 и SOD (супероксиддисмутаза) приводит к потере мтДНК. Это доказывает, что повреждения от окислительный стресса вносят основной вклад в геномную нестабильность митохондриального генома дрожжей. PMID:

27 Для тимингликоль-гликозилазы Млекопитающих hNTHL1 данные противоречивы: по одним данным она локализована в ядре и митохондриях, по другим – только в ядре. удаление тимингликоля не происходит в митохондриях из клеток мышей nth-/-, но в то же время другой группой показано удаление тимингликоля в экстрактах митохондрий мышей nth-/-.

28 Продукты дезаминирования

29 Сущестуют ядерная и митохондриальная формы урацил-ДНК- гликозилазы. Они образуются с двух разных промоторов одного гена и в результате альтернативного сплайсинга. У дрожжей одна лизоформа этого фермента, в нем есть сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации. Удаление урацила, образованного при дезаминировании цитозина, осуществляет урацил-ДНК-гликозилаза UNG2UNG1 PMID:

30 Наиболее распространенные продукты алкилирования: О-4-alkylT О-6-alkylG

31 Алкилированные основания удаляет N-methylpurine-DNA-glycosylase (MPG или AAG – от alkyladenine-DNA-glycosylase или 3- methyladenine-DNA-glycosylase). Этот фермент не обнаружен в митохондриях, но в митохондриях препарируются повреждения, обычно служащие субстратами этого фермента.

32 Base excision repair (BER) в митохондриях: АР эндонуклеазы Основная АР эндонуклеаза Млекопитающих АРЕХ1 локализована как в ядре, так и в митохондриях. Митохондриальная форма короче ядерной. Есть и другая АР эндонуклеаза АРЕ2, частично транспортируемая в митохондрии, но её каталитическая активность низка, функции требуют дальнейшего изучения. У дрожжей основная эндонуклеаза Apn1 на N-конце имеет митохондриальную адресную последовательность и сигнал ядерной локализации на C-конце. Apn1 транспортируется в митохондрии, взаимодействуя с Pir1 – белком клеточной стенки дрожжей. Pir1 конкурирует с ядерными белками за связывание с сигналом ядерной организации, что позволяет части Apn1 импортироваться в митохондрии.

33 Base excision repair (BER) в митохондриях: застраивание бреши и лигирование АР эндонуклеаза освобождает OH-группу на 3-конце бреши, но механизм дальнейшей репарации зависит того, какая группа расположена на 5-конце. В митохондриях застраивание бреши осуществляет ДНКполимераза γ, у неё есть и полимеразная и лиазная активность, но последняя слабее, чем у DNA pol β, осуществляющей BER в ядре.

34 В случае, если АР эндонуклеаза и ДНК- полимераза может оставить на 5-конце фосфат, репарация идет по механизму short patch BER – вставляется только один нуклеотид. В случае, если продукт вырезания устойчив к лиазной активности ДНК- полимеразы (например, при образовании 2- deoxyribonolactone) - репарация идет по механизму long patch BER – вставляется 2-6 нуклеотидов.

35 Base excision repair (BER) в митохондриях: PMID: Считается, что в long patch BER в митохондриях участвуют FEN1 и хеликаза DNA2. Последняя стадия BER- репарации – лигирование. В митохондриях человека лигирование проводит DNA ligase 3 (LIG3). У дрожжей в митохондриях работает LIG1.

36 ROS, образованные вне митохондрии или в результате утечки электронов из ЭТЦ повреждают свободные dNTP и мтДНК. Сигнал о повреждении поступает в цитозоль, белки системы репарации транспортируются в митохондрию (возможно, за счет посттрансляционных модификаций). Передача сигнала о повреждении мтДНК может дополняться передачей сигнала о повреждении ядерной ДНК для перераспределения факторов репарации. Происходит изменение локализации OGG1, UNG1 и NTH1 и дрожжевого NTG1. Регуляция BER Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым. PMID:

37 Уничтожение окисленных dNTPs (I) Short-patch BER (II) Long patch BER (III) Регуляция репарационных просессов (IV- V) Зеленым выделены главные факторы репарации; дополнительные факторы – желтым и фиолетовым; ДНК связывающие белки выделены серым. Основные пути репарации в митохондриях:

38 ROS Factors from cytoplasm TFAM участвует в репарации мтДНК. TFAM связывается с поврежденной ДНК прочнее, чем с интактной. У TFAM аффинность к ДНК, содержащей 8-охот, выше, чем у гликозилаз OGG1 и MYH. Клетки, устойчивые к циспластину (алкилирующий агент), гиперэксперессируют TFAM и TRX2 (тиоредоксин 2). TFAM связывается с р 53, который тоже может регулировать его связывание с ДНК в зависимости от вида повреждения. 3-5 экзонуклеазная активность р 53 может удалять 8-охот на 3-конце, эта реакция усиливается SSB.

39 1. В митохондриях происходит репарация BER двух типов: SP (short patch) BER LP (long patch) BER 2. Основные стадии BER: Гликозилаза удаляет поврежденное азотистое основание АР-эндонуклеаза освобождает 3-конец бреши В зависимости от группы на 5-конце бреши ДНК полимераза ɣ застраивает брешь одним (SP BER) или несколькими (LP BER) нуклеотидами. FEN1 и DNA2 участвуют в LP BER LIG 3 зашивает разрыв 3. Существует регуляция BER в митохондриях: Многие ферменты переходят в митохондрии в ответ на сигналы о повреждениях В репарации BER участвуют TFAM и p53

40 MMR – mismatch repair Удаление несоответствий и небольших петель. Эффективность невысокая, т.к. не всегда происходит верный выбор материнской цепи, что приводит к мутациям. Удаление несоответствий - некомплементарных пар G:T и G:G показано в лизатах митохондрий млекопитающих. Одним из основных факторов MMR в ядре служит YB-1, предполагается, что он является ключевым компонентом MMR и в митохондриях.

41 YB-1 в отличие от остальных участников ядерной MMR (MSH1, MSH3, MSH6) частично локализован в митохондриях. В митохондриальных экстрактах из клеток с отсутствием MSH2 наблюдается MMR => механизм MMR в митохондриях отличается от ядерного. MMR в экстрактах митохондрий снижается при уменьшении уровня YB-1 (нокдаун siRNA). PMID:

42 Вопрос о наличии MMR в митохондриях остается открытым. BER тоже может репарировать несоответствия. Существует предположение, что MMR необходима для удаления маленьких петель в большей степени, чем несоответствий в парах нуклеотидах.

43 Double-strand break repair Есть доказательства наличия в митохондриях обоих механизмов: NHEJ (non-homologous end joining) и HR (homologous recombination). RAD51 – основной фермент HR в ядре – локализован также в человеческих митохондриях :

44 Rad 51 переходит в митохондрии в ответ на окислительный стресс. Для перехода Rad 51 необходима репликация. PMID:

45 Direct repair ( без разрезания фосфодиэфирной связи) Повреждения ДНК УФ излучением в ядре репарирует фотолиаза, её активность не показана в митохондриях Млекопитающих. У дрожжей фотолиаза работает в митохондриях. O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) – основной фермент прямого репарирования алкилированных оснований в ядерной ДНК. Есть данные, что MGM присутствует в митохондриях, но может репарировать только метилированные и этилированные основания.

46 NER – nucleotide excision repair Считается, что этот механизм отсутствует в митохондриях. В митохондриях дрожжей индуцированные УФ пиримидиновые димеры препарируются эндонуклеазой Rad2. Этот механизм UVER (UV excision repair) одновременно похож и на BER, и на NER. Белки, участвующие в ядерной NER CSA (от Cockayne Syndrome) и CSB обнаруживаются в митохондриях Млекопитающих в условиях окислительного стресса. Они связываются с мтДНК и компонентами BER. Возможно, в митохондриях есть отличный от ядра механизм NER, который еще будет исследован.

47 В митохондриях происходит репарация двух типов: BER – base excision repair MMR – mismatch repair 2. В митохондриях отсутствует NER – nucleotide excision repair 3. Наличие репарации при двуцепочеченых повреждениях мтДНК не изучено, но Rad 51 поступает в митохондрии в условиях окислительного стресса и участвует в репликации.

48 CSB (от Cockayne Syndrome) рекрутирует факторы BER к мембране; CSA and CSB взаимодействуют с SSB и гликозилазой; p53 стимулирует гликозилазу и POLγ; PARP-1 модулирует BER. Регуляция и топология репарации в митохондриях PARP1 – Poly (ADP-ribose) polymerase – ключевой ядерный фермент репарации однонитевых разрывов. Такие разрывы образуются при BER, поэтому PARP1 влияет и на BER. PARP1 локализована в митохондрии и участвует в поддержании целостности мтДНК. PARP1 входит в комплекс, включающий мтДНК и лигазу 3.

49 Мт ДНК связана с внутренней мембраной. Один из белков, связывающих ДНК с мембраной – М19, вероятно, участвуют также РНВ1 (prohibitin1) и ATAD3 (белок внутренней мембраны, ответственный за перемещения D-loop). Большинство компонентов BER связаны с внутренней мембраной (кроме АР- эндонуклеазы). Но стабильного комплекса компоненты BER не образуют. Есть данные, что CSB вовлечен в сборку и сохранение комплекса мтДНК и компонентов BER: он связывает SSB и OGG1 в один комплекс с мтДНК.

50 Есть две модели: мтДНК мобильна и проходит через комплексы, расположенные на внутренней мембране, для репликации, репарации и. т. д. мтДНК заякорена на внутренней мембране.

51 Регуляция репарации мтДНК Мт лизоформы многих ферментов мт репарации образуются с помощью альтернативного сплайсинга, а, значит, возможна посттранскрипционная регуляция. Есть данные по NTG1 и NTG2 дрожжей. NTG1 динамично перераспределяется между ядром и митохондриями при окислительном стрессе. Переход NTG1 в митохондрии зависит от окислительных повреждений, но не от уровня ROS. Значит, есть специфичные сигналы об этих повреждениях, исходящие из митохондрий. Некоторые белки с двойной ядерной и митохондриальной локализацией обнаруживаются в митохондриях только в условиях окислительного стресса: Rad51, APEX1, CSA и CSB. Многие белки имеют сигналы как ядерной, так и митохондриальной локализации: NTG1, UNG1, APE1 у дрожжей и hOGG1a, hNTHL1 у Млекопитающих. Возможно, механизм, показанный для NTG1, является общим. Окислительный стресс вызывает переход р 53 в митохондрии.