Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с после колоночной реакцией и флуоресцентным детектированием МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова Химический факультет Кафедра аналитической химии Москва, 2014 И. Д. Каргин Научный руководитель: д.х.н., проф. А.В. Пирогов

2 Тетрациклины Тетрациклин (TC) ( г/моль) Окситетрациклин (OTC) ( г/моль) Доксициклин (DC) ( г/моль) ПДК = 10 нк / г

Фармaкологические препараты Ветеринария Животноводство Применение тетрациклина 3 ПДК = 10 нк / г

Создание способа чувствительного определения антибиотиков тетрациклинового ряда с использованием микроэмульсий методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием Изучение влияния состава микроэмульсий на флюориметрические свойства исследуемых соединений Цели работы 4

5 Типы микроэмульсий: А – «масло в воде» В – «вода в масле» С – биконтинуальная микроэмульсия Структура микроэмульсии н-октан Вода

Свойства микроэмульсий 6

7 УФ-детектирование Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 10 мкг/мл каждого ТС). Колонка Zorbax Eclipse XDB-C × 4.6 мм (5 мкм). Градиентный режим, элюент – (А) 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH 3; (В) MeCN. Градиент: (0-4 мин) 20% (В), (4-10 мин) линейное увеличение до 40% (В). F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм. Соединениеt R, мин Ширина пика, минRsRs AsAs c min, нк/мл OTC – TC DC

8 Режим МЭЖХ mAU t R,мин OTC + TC DC Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 1 мкг/мл каждого). Элюент – (А) - МЭ (3.3% ДДСН, 0.8% н-гептана, 8% н-бутанола), (Б) - МЭ (2% ДДСН, 0.6% н-гептана, 6% н-бутанола). pH 3, F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм. Подвижная фаза Соединен ие t R, мин Ширина пика, мин Rs c min, нк/мл МЭ 2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанола OTC –180 TC DC MeCN/0.01М р-р щавелевой к-ты OTC –110 TC DC (А) (Б)

Комплексообразование с катионами металлов Предполагаемые структуры комплексов тетрациклина с катионами магния и кальция У комплекса тетрациклина с катионом магния наблюдается сильное увеличение интенсивности флуоресценции ( ̴ 20 раз) 9 g g Спектры флуоресценции (λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм): 1 – 10 мкг/г ТС в МЭ 2 – 10 мкг/г ТС в МЭ + Mg 2+ (избыток) 1 2

10 с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм Выбор pH и концентрации ионов Mg 2+

Название ПАВСтруктурная формулаI fl, у.е. Додецилсульфат натрия (ДДСН) 45 Докузат натрия (ДЗН)41 Цетилтриметиламмония хлорид (ЦТАХ) ДДСН ДКЗ ЦТАХ Изучение влияния природы ПАВ на флуоресценцию комплексов ТС с Mg 2+ с(ТС) = 10 мкг/мл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм

12 Схема проведения после колоночной реакции Насос 1 Насос 2 Колонка Реакционная петля ФЛ детектор Ввод пробы 20% MeCN 80% 0.01 M р-ра щавелевой к-ты рН М р-р MgCl 2 в МЭ состава: 4% ДДСН 1.2% н-гептана 12% н-бутанола рН 9 Металлический капилляр L = 2 м D = 0,25 мм V = 980 мкл ТС Элюат ТС-Mg рН 7.8 Т = 50°С

Кинетика реакции комплексообразования Реакция тетрациклина с ионами магния в среде микроэмульсии Условия: МЭ (2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанол), содержащая 0.06 М Mg 2+, pH 9, с(ТС) = 10 мкг/мл Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ТС с Mg 2+ от времени, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм. 13

Варьирование температуры и скорости подачи элюента 14 Скорость подачи элюента и микроэмульсии с магнием одинакова С ростом температуры понижается вязкость МЭ

15 Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов с концентрациями 0.05 мг/мл. Элюент: А – 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH = 3; В – MeCN. Градиентный режим: 0 мин – 20% А, (0 – 9) мин – 35% А, (9 – 14) мин – 35% А, (14 – 18) мин – 20% А. F = 0.4 мл/мин, Т = 50°C. Послеколоночная реакция – 60 мМ раствор MgCl 2 в МЭ (4% ДДСН, 1.2% н-гептана, 12% н-бутанола). F = 0.4 мл/мин, V = 100 мкл, λ Ex / λ Em = 385 / 512 нм. ОФ-ВЭЖХ с после колоночной реакцией Соединениеt R, мин Ширина пика, минRsRs AsAs с min, нк/мл OTC – TC DC

Пробоподготовка фармацевтических препаратов Навеска препарата Экстракция в микроэмульсии на УЗ бане Центрифугирование Разбавление подвижной фазой 16 2 минуты, 16 тыс. об./мин Объем МЭ – 10 мл Время экстракции – 5 минут Температура – 60 о С Навеска г Разбавление в 100 раз смесью 80% 0.01 M р-ра щавелевой кислоты 20% MeCN

Анализ тетрациклиновой мази 17 Хроматограмма тетрациклиновой мази 3%. ТС

Степени извлечения тетрациклина из мазей 18

Пробоподготовка молока 5 мл молока мл буферного р-ра Ультразвуковая обработка Центрифугирование ТФЭ Разбавление подвижной фазой 19 5 минут, 16 тыс. об./мин Время обработки – 5 минут 0.1 М р-р ЭДТА в буферном растворе Мак Илвейна, рН 4 Разбавление 0,01 M р-ром щавелевой кислоты 2 минут, 16 тыс. об./мин 3 мл MeCN, 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 12 мл над осадочной жидкости 3 мл H 2 O, 3 мл буф. р-ра 1 мл MeCN

20 Хроматограмма реального объекта (молоко) Участок хроматограммы образца молока «Лианозовское».

21 Хроматограмма реального объекта (молоко) Хроматограммы холостого образца молока (A) и молока с добавкой тетрациклинов (Б). Концентрации добавок составляли 20, 20 и 40 мкг/л для OTC, TC и DC соответственно.

22 Выводы 1. Впервые показано, что интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов с ионами Mg 2+ в микроэмульсионной среде в 1.8 раза выше по сравнению с водно- органической средой. 2. Изучено влияние природы ПАВ в составе микроэмульсии на интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов. Показано, что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в МЭ на основе анионного ПАВ ДДСН. 3. Впервые предложена схема проведения после колоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами Mg 2+ в среде микроэмульсий. 4. Выбраны условия чувствительного и селективного хроматографического определения тетрациклинов в виде комплексов с флуоресцентным детектированием в фармацевтических препаратах (мази и таблетки) и пищевых объектах (молоко). Пределы обнаружения составили 5, 8 и 25 нк/мл для TC, OTC и DC соответственно. 5. Выбраны условия извлечения тетрациклинов из молока, степени извлечения составили 87, 82 и 68% для TC, OTC и DC соответственно. Также в ходе дополнительной очистки образцов с помощью ТФЭ картриджа Strata XDB-L достигнута степень концентрирования тетрациклинов, равная В работе показана перспективность использования МЭ для количественного извлечения тетрациклина из лекарственных форм на основе мазей. Степени извлечения составили %. Время пробоподготовки занимает 15 минут.

Спасибо за внимание! 23