1 Масс спектрометрия или Масс спектроскопия Абсолютная и относительная масса 12C = Молекулярная вес Мr (отн. ед) и Молекулярная масса (в Да) Ионы в электрическом и магнитном поле где z –заряд иона, m – его масса, V acc - разница потенциалов приложенного электрического поля, r - радиус кривизны траектории иона, B - величина приложенного магнитного поля Легкие ионы будут иметь маленький радиус кривизны. Этот радиус будет увеличиваться с ростом массы иона и ускоряющего потенциала поля. Кинетическая энергия иона Е кин Сила Лоренца (электрическая ускоряющая сила) (отклоняющая магнитная сила)

2 Перенос ионов из раствора в газовую фазу требует большой энергии и не происходит самопроизвольно. Например, перенос иона Na+ требует 98 ккал/моль. Поэтому перенос десятков тысяч ионoв в газовую фазу из раствора в масс спектрометре требует очень большой затраты энергии От ионов в растворе - к ионам в газовой фазе Способы получения ионов 1)Удаление электронов из молекулы для получения позитивно заряженного катиона, который может быть ускорен либо увеличением отрицательного градиента или уменьшением позитивного градиента поля. 2)Добавление электрона к молекуле для получения отрицательно заряженного аниона. В этом случае знак ускоряющего напряжения противоположен знаку, требуемому для катиона. 3) Удалением или добавления протона. В этом случае результирующая масса будет отличаться на ±1 от массы исходного нейтрального иона. Техника ионизации Электронная ионизация Ионизация полем Бомбардировка быстрыми атомами Плазменная ионизация Лазерная ионизация с использованием матрицы (MALDI) Ионизация электрораспылением (ESI)

3 Лазерная ионизация с использованием матрицы (MALDI) Матрица – ключевой элемент техники. Ее главная роль: содержать хромофор, поглощающий лазерное излучение. Последнее не должно затрагивать хромофоры исследуемой молекулы. Матрица испаряясь переходит в газовую фазу, увлекая за собой исследуемую молекулу. Специфика лазерного излучения. Два типа лазеров используются в технике MALDI: Инфракрасный лазер, возбуждающий вибрационные моды и УФ - лазер, возбуждающий электронные переходы в молекуле. Длина импульса обычно составляет 100 нс или меньше. Большие длины импульсов обычно приводят к тепловому разложению образца. Специфика масс- спектрометра Поскольку большинство лазерных источников являются пульсирующими, то для регистрации используются такие методы как метод времени пролета или метода ионного циклотронного резонанса. Точность определения массы составляет ± 0.01% (±1 Da при молекулярной массе 10 кДa).

4 Ионизация электрораспылением Схематическое представление прохождения ионов от кончика иглы, содержащего раствор биологических макромолекул, до детектора масс спектрометра. Раствор белка (объем μл, концентрация - 5 μM) выходит из тонкого капилляра (внутренний диаметр около 10 μм). К концу капилляра, покрытого золотом, прикладывается высокое напряжение (обычно несколько кВ), вызывая распад капель на очень мелкие капли. Десольватация последних приводит к появлению облака молекул, которые детектируются масс спектрометром. Точность определения молекулярных масс составляет %.

5 Инструменты и техника регистрации в масс спектрометрии Single and double focusing mass spectrometers Fourier transform mass spectrometry Ion cyclotron resonance mass spectrometry Quadrupole mass filter Quadrupole ion trap Triple mass filter

6 Определение масс белков ESI-FTIR масс спектр двух белков: цитохрома c и миоглобина лошади. Концентрация образца 0.4 нM. Общее количество белка около 135 зM (~ молекул). 1 зепто моль = моля МАЛДИ спектр высокого разрешения белка [Arg8]-вазопресина. Основной спектр относится к «моноизотопному» пику протонированного белка. Три пика более высокой массы относятся к вкраплению в белок изотопа 13C, доля встречаемости которого в природе равна 1.108% Da +2Da +3Da Моноизотопная масса horse cytochrome c horse myoglobin [Arg8]-вазопресин

7 Применяя формулу (А) для расчета молекулярной массы цитохрома c с использованием двух соседних пиков с = и = , получим для следующее значение: Это означает, что 12 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой, равной Молекулярная масса в этом случае рассчитывается как М = n 2 (m 2 -1) и равна Рассматривая следующие два пика с относительными массами = и = 952.3, мы получим: или Z = 13, т.е. 13 положительных зарядов ассоциированы с относительной массой Рассчитанная из этих пиков молекулярная масса равна Молекулярная масса нейтральной молекулы M может быть найдена из значений регистрируемых масс m 1 и m 2 и (что эквивалентно значениям m/z) и числа добавленных зарядов или протонов n 1 и n 2 : М = n 2 (m 2 - 1) (A) где n 1 = n 2 +1 и n 2 = (m 1 -1) / (m 2 - m 1 ) Следовательно, M, можно рассчитать, если брать пики регистрируемых масс попарно. Цитохром с

8 Сворачивание белков: конечные и промежуточные состояния Цитохром c Апомиоглоин Кислая денатурация миоглобина Различные pH Различные моменты времени

9

10 Нуклеиновые кислоты и их комплексы с белками. Проблема: «любовь НК» к ионам. Гистограмма средних масс образца ДНК. Доминантный пик 2.88 MДa соответствует Na-бактериальной ДНК плазмиде (pBR322), а меньший пик ее димеру (Benner, 1997). Расчетное значение молекулярной массы 30S субьединицы равно ± 3918 Дa. Эта величина на 0.6% отличается от «точного значения», вычисленного из составляющих ее компонентов (16S РНК и белков). 5 мМ Мg 1 mM Mg bacterial plasmid (pBR322) Димер Мономер

11 Статический и динамический протеомы и масс-спектрометрия Две стратегии анализа протеома методом масс спектрометрии (Godovach- Zimmermann and Brown, 2001).

12 Формирование изображения с помощью масс спектрометрии Методология пространственного анализа ткани методом MALDI-MS. Замороженные секции помещаются на металлической плате и покрываются UV- абсорбирующей матрицей. Затем они помещаются в масс- спектрометр и сканируются лазерным лучом. (Stoeckli et al., 2001, Nature Medcine, 7, p.494). Масс спектрометрическое изображение замороженных секций ткани мозга мыши. (а) Оптическое изображение замороженной секции на золотой подложке. (b) Распределение белков с m/z = 8528 в области центральной коры головного мозга (c) Тоже для m/z 6716 в области медиальных сучковатых ядер. (d) Тоже для m/z 2564 в области среднего мозга.