Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Изобретение ПЦР Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис (Kary Mullis). Kary Mullis, Лауреат Нобелевской премии 1993 г. по химии

Принципы технологии ПЦР Мишень – генетический материал. Метод прямого выявления возбудителя, основанный на универсальности способа хранения и передачи генетической информации. Высокая чувствительность, основанная на принципе экспоненциального накопления продукта. Высокая специфичность, основанная на выявлении уникальных последовательностей генома.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Компоненты реакции Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции рН, ионную силу раствора.

Принцип метода заключается в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНК- полимеразы. За каждый следующий цикл амплификации происходит удвоение как исходного участка ДНК, так и вновь синтезированных фрагментов (амплификатор).

В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии (цепная реакция). После циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами.

Проблемы при использовании ПЦР в лабораторной диагностике Высокий риск контаминации продуктами ПЦР Субъективизм в интерпретации данных электрофореза и сложность автоматизации процесса Отсутствие связи между начальной концентрацией ДНК и конечной концентрацией продукта

Необходимость в отдельных помещениях (зонах) для выделения НК, постановки ПЦР и проведения электрофореза.

Отсутствие стандартизации электрофоретического этапа ПЦР-анализа Субъективное восприятие лаборантом «спорных» результатов. Отсутсвие стандартных параметров при регистрации изображения с помощью трансиллюминаторов,видеосистем и др.

Субъективизм в интерпретации полученных данных, основанных на визуальном анализе электрофореграмм.

Расширение возможностей полимеразной цепной реакции – использование метода Real-time PCR (ПЦР с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени)

ПЦР в реальном времени Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации.

Преимущества ПЦР в реальном времени: -все операции проводятся в одной пробирке; - исключается риск контаминации ПЦР- смеси и продуктов; -быстрота анализа; - возможность автоматизации; - экономия затрат времени и труда.

Детекция накопления продуктов реакции (ампликонов) может измеряться двумя способами: неспецифический, с помощью интеркалирующих флуоресцентных красителей (напр. SYBRGreen, SYBR Gold) с помощью олигонуклеотидов с флуоресцентными метками (повышает специфичность реакции); этот способ используется чаще.

Для проведения анализа необходим специальный прибор - амплификатор для ПЦР в реальном времени, который совмещает в себе функции термоциклера и флуоресцентного детектора.

Метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда. В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´- экзонуклеазой активности, которой обладает ДНК- полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.

Заключение В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой гена диагностической технологии - количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов – ПЦР в реальном времени. В ближайшие годы данная технология будет применяться в гепатологии (вирусные гепатиты В и С), в клинике ВИЧ и ВИЧ- ассоциированных инфекций (в первую очередь герпетическая и цитомегаловирусная инфекции), в дерматовенерологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, пульмонологии. С помощью ПЦР в реальном времени будет оцениваться эффективность проводимой терапии и клинический прогноз заболевания.