РУДН. Кафедра биологии и общей генетики Лекция РУДН. Кафедра биологии и общей генетики Гигани Ольга Олеговна Лекция Синтез ДНК. Нарушения в структуре ДНК. Репарация ДНК.

Принципы репликации: матричность и комплементарность матричность и комплементарность антипараллельность антипараллельность униполярность униполярность прерывистость прерывистость полуконсервативность (М.Мезелсон, Ф.Сталь, 1958) полуконсервативность (М.Мезелсон, Ф.Сталь, 1958) Возможный механизм репликации предложили Ф.Крик и Дж.Уотсон,1953 г. Возможный механизм репликации предложили Ф.Крик и Дж.Уотсон,1953 г. А.Корнберг, 1957, открытие ДНК-полимеразы I А.Корнберг, 1957, открытие ДНК-полимеразы I

Условия репликации матрица матрица ферменты ( реплисома - многокомпонентный белковый комплекс, осуществляющий двунаправленный синтез ДНК ) ферменты ( реплисома - многокомпонентный белковый комплекс, осуществляющий двунаправленный синтез ДНК ) dNTP (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) dNTP (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) Mg 2+ Mg 2+ ATP ATP NTP ( для синтеза олигорибонуклеотидов - праймеров ) NTP ( для синтеза олигорибонуклеотидов - праймеров )

Способы репликации (тета) – тип (тета) – тип (сигма) – тип (сигма) – тип репликация линейных молекул репликация линейных молекул

инициация элонгация терминация инициация элонгация терминация точка Ori, от англ. Origin точка Ori, от англ. Origin репликон репликон скорость репликации: скорость репликации: прокариоты: 1500 пн/сек прокариоты: 1500 пн/сек эукариоты: пн/сек эукариоты: пн/сек (dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + P-P (dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + P-P

Инициация репликации инициаторные белки DNA A,В,С… инициаторные белки DNA A,В,С… АТР-зависимая ДНК-геликаза АТР-зависимая ДНК-геликаза SSB – белки SSB – белки ДНК-топоизомераза ДНК-топоизомераза

Элонгация репликации праймаза, праймосома, праймер праймаза, праймосома, праймер ДНК-полимеразы ДНК-полимеразы фрагменты Оказаки фрагменты Оказаки ДНК-лигаза ДНК-лигаза

Репликативная вилка Лидирующая цепь Запаздывающая цепь

ДНК-полимеразы прокариот ДНК-полимераза I 3-экзонуклеаза (С-конец, фрагмент Кленова) 3-экзонуклеаза (С-конец, фрагмент Кленова) 5- экзонуклеаза (N-конец) 5- экзонуклеаза (N-конец) одиночный полипептид одиночный полипептид ДНК-полимераза III основной фермент элогнации основной фермент элогнации 3-экзонуклеаза 3-экзонуклеаза высокое сродство к матрице (процессивность в 60 раз выше, чем у ДНК- полимеразы I) высокое сродство к матрице (процессивность в 60 раз выше, чем у ДНК- полимеразы I) много субъединиц много субъединиц

Репликация у эукариот много репликонов, их длина т.п.н. много репликонов, их длина т.п.н. в S-фазе клеточного цикла в S-фазе клеточного цикла ДНК-полимеразы: ДНК-полимеразы: α – основной фермент (полимераза, праймаза), синтез фрагментов Оказаки (или только праймаза?) α – основной фермент (полимераза, праймаза), синтез фрагментов Оказаки (или только праймаза?) β - фермент репарации β - фермент репарации γ - синтез мтхДНК γ - синтез мтхДНК δ - синтез лидирующей цепи δ - синтез лидирующей цепи - при репарации замещает - при репарации замещает

Репликация у эукариот факторы репликации: факторы репликации: факторы FEN-1 или MF-1 обладают активностью 5 3-экзонуклеазы и участвуют в созревании фрагментов Оказаки. Для удаления праймеров также используется РНКаза H1 факторы FEN-1 или MF-1 обладают активностью 5 3-экзонуклеазы и участвуют в созревании фрагментов Оказаки. Для удаления праймеров также используется РНКаза H1 длина фрагментов Оказаки н. длина фрагментов Оказаки н. теломераза теломераза

Теломераза 1971 г., А.М.Оловников, предсказал механизм защиты хромосом от укорачивания при каждом делении клетки 1971 г., А.М.Оловников, предсказал механизм защиты хромосом от укорачивания при каждом делении клетки 1984 г., К.Грейдер – открытие теломеразы 1984 г., К.Грейдер – открытие теломеразы 2009 г., К.Грейдер, Э.Блекберн, 2009 г., К.Грейдер, Э.Блекберн, Д.Шостак – Нобелевская премия Д.Шостак – Нобелевская премия рибозим, 150 н. РНК рибозим, 150 н. РНК удлиняет 3 конец матрицы ДНК удлиняет 3 конец матрицы ДНК

Регуляция репликации сфингозин – в малых дозах стимулирует, в больших – подавляет синтез ДНК сфингозин – в малых дозах стимулирует, в больших – подавляет синтез ДНК рифампицин и актиномицин D блокируют репликацию рифампицин и актиномицин D блокируют репликацию ингибиторы гираз (ДНК-топоизомераз) ингибиторы гираз (ДНК-топоизомераз)

Полимеразная цепная реакция 1983 г. К. Мюллис (1993 г. – Нобелевская премия) 1983 г. К. Мюллис (1993 г. – Нобелевская премия) В основе – принципы и механизмы естественной репликации ДНК. В основе – принципы и механизмы естественной репликации ДНК. Позволяет амплифицировать (многократно увеличить количество копий, клонировать) in vitro фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Позволяет амплифицировать (многократно увеличить количество копий, клонировать) in vitro фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Амплификатор, термоциклер Амплификатор, термоциклер

Применение ПЦР Используется: Используется: в диагностике инфекционных заболеваний в диагностике инфекционных заболеваний для определения генотипа организма для определения генотипа организма для изучения экспрессии генов для изучения экспрессии генов для идентификации личности для идентификации личности для установления родственных связей для установления родственных связей в молекулярно-биологических и молекулярно- генетических исследованиях в молекулярно-биологических и молекулярно- генетических исследованиях с помощью ПЦР удалось амплифицировать фрагменты мтхДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет с помощью ПЦР удалось амплифицировать фрагменты мтхДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет

MasterMix праймер R праймер R праймер L праймер L буфер 10х буфер 10х смесь dNTP смесь dNTP матрица (ДНК) матрица (ДНК) вода деионизированная вода деионизированная ДНК-полимераза (Taq-полимераза) ДНК-полимераза (Taq-полимераза) вазелиновое масло вазелиновое масло

Полимеразы для ПЦР Taq – полимераза (Thermus aquaticus, обитает в горячих источниках), лишена 3-экзонуклеазной автивности Taq – полимераза (Thermus aquaticus, обитает в горячих источниках), лишена 3-экзонуклеазной автивности Pfu-полимераза (Pyrococcus furiosus, («яростные огненные шарики», экстремально термофильные бактерии, до 103°С), обладает 3-экзонуклеазной автивностью, но низкой процессивностью Pfu-полимераза (Pyrococcus furiosus, («яростные огненные шарики», экстремально термофильные бактерии, до 103°С), обладает 3-экзонуклеазной автивностью, но низкой процессивностью

Каждый цикл ПЦР включает 3 этапа: 1. Денатурация (плавление) (плавление) t 92-95°С 2. Отжиг с праймерами t 50-60°C 3. Полимеризация (элонгация) t 72°

Денатурация I Отжиг с праймерами I Элонгация I Денатурация II Отжиг с праймерами II Элонгация II Итог II цикла

Гель - электрофорез Агарозный гель, бромистый этидий Агарозный гель, бромистый этидий ДНК – продукт ПЦР

Разновидности ПЦР «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) – c используется вторая пара праймеров,, с помощь которой амплифицируется полученный ранее ампликон «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) – c используется вторая пара праймеров,, с помощь которой амплифицируется полученный ранее ампликон RT-PCR (Reverse Transcription PCR, ПЦР с обратной транскрипцией). Для изучения экспрессии генов. РНК ДНК ПЦР. RT-PCR (Reverse Transcription PCR, ПЦР с обратной транскрипцией). Для изучения экспрессии генов. РНК ДНК ПЦР. Ассиметричная ПЦР (Аssimetric PCR) – для амплификации преимущественно одной цепи; используют разные количества праймеров Ассиметричная ПЦР (Аssimetric PCR) – для амплификации преимущественно одной цепи; используют разные количества праймеров ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) для амплификации фрагментов более 10 т.п.н. Используют две полимеразы (Taq и Pfu). ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) для амплификации фрагментов более 10 т.п.н. Используют две полимеразы (Taq и Pfu).

Разновидности ПЦР Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) c использованием флуоресцентно меченых атомов, позволяющая отслеживать количество наработанного продукта в каждом цикле ПЦР в реальном времени Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) c использованием флуоресцентно меченых атомов, позволяющая отслеживать количество наработанного продукта в каждом цикле ПЦР в реальном времени Multiplex PCR – при использовании нескольких пар праймеров одновременная амплификация несколькоких фрагментов Multiplex PCR – при использовании нескольких пар праймеров одновременная амплификация несколькоких фрагментов