Российский Государственный Медицинский Университет Кафедра биофизики Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико- биологических исследованиях А. Н. Осипов, Ю.А. Владимиров

Часть Часть 1. Основы метода ЭПР Электронный Парамагнитный Резонанс

Электронный парамагнитный резонанс Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, EPR, ESR) - один из основных прямых методов обнаружения и идентификации (изучения строения) свободных радикалов и комплексов металлов переменной валентности, имеющих неспаренный электрон на молекулярной орбитали. В основе метода лежит резонансное поглощение электромагнитного излучения неспаренными электронами, помещенными в магнитное поле. Электрон в атоме участвует в двух видах движения: 1. Орбитальном ( l ) - вокруг ядра атома и 2. Спиновом (s) - вокруг собственной оси. Каждый вид движения можно охарактеризовать двумя моментами: 1. Механическим (P), отражающим движение материальной частицы и 2. Магнитным ( ), отражающим движение заряженной частицы. P s s P l l Атом водорода

Взаимосвязь механического и магнитного моментов P s s P l l Из классической механики известно, что момент количества движения электрона на круговой орбите радиуса R P=mvR, где m - масса электрона, а v - его скорость. Движение заряженной частицы по такому же контуру, создает магнитный момент, подобный тому, что возникает при движении тока =IS, где I - сила тока в контуре (I=ve/2 R), а S - площадь контура (S= R 2 ) или =veR/2 или, учитывая (P=mvR) =-eP/2m (или /P=-e/2m) Из квантовой механики известно, что P=nh/2 где n - главное квантовое число. Тогда при n=1 получим =-eh/4 m= магнетон Бора

Суммарный магнитный момент Таким образом, для орбитального движения l /P l =-e/2m Для спинового движения s /P s =-e/m Суммарный магнитный момент равен: j = l + s, А суммарный механический равен: P j =P l +P s Однако j /P j l /P l s /P s поэтому вводят коэффициент пропорциональности (g) j /P j =-g*e/2m, где g это g-фактор, т.е. коэффициент, показывающий вклад орбитального и спинового момента в суммарный момент. В конечном итоге, поскольку l s, то j s и j -g*e/2m*h/2 *S =-g S

Энергия электрона в магнитном поле равна E= *H*cos(,H), где - суммарный магнитный момент электрона, H - напряженность магнитного поля, cos(,H) - угол между векторами и H (обычно = 1 или -1), тогда подставив значение получим E=-g SH, Где S - спиновое квантовое число = +1/2 или -1/2. В итоге E=±1/2g H

Ориентация электронных спинов в магнитном поле Магнитный момент электрона В отсутствие внешнего магнитного поля все механические и магнитные спиновые моменты электрона ориентированы случайным образом В присутствии внешнего магнитного поля они могут быть ориентированы только двумя способами: по полю или против поля. H В отсутствие магнитного поля При включенном магнитном поле

H E При наложении магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются по полю или против поля. Их энергии изменяются, а энергетический уровень расщепляется на два. H 1 2 g H. E0 В отсутствие внешнего магнитного поля электроны ориентированы случайным образом и имеют практически одинаковую энергию (E 0 ) Расщепление энергетических уровней в магнитном поле (эффект Зеемана) H=0 1 2 g H

gHh H E -1/2 g H Система, где электроны распределены между двумя энергетическими уровнями, может поглощать электромагнитное излучение. При определенных значениях величины энергии падающего кванта (h ), будут происходить переходы электронов между уровнями. +1/2 g H E = h E = g H Поглощение будет происходить при условии равенства энергий поглощаемого кванта и энергии перехода между уровнями, т.е. когда h = g H Это выражение называется – основным уравнением резонанса Поглощение электромагнитных волн (явление ЭПР)

Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков? Разность между числом электронов (заселенностью) на двух разных энергетических уровнях в парамагнетиках определяется уравнением Больцмана: n s=½ - число электронов c s=½. n s= -½ - число электронов c s= -½. n s=½ парамагнетик диамагнетик n s= -½ n s=½ n s= -½

Метод был открыт Евгением Константиновичем Завойским в Казанском Университете в 1944 году. Он заметил, что монокристалл CuCl 2, помещенный в постоянное магнитное поле поглощает радиоволны в микроволновом диапазоне. Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые в 1958 с помощью метода ЭПР обнаружили свободные радикалы полученные под действием ионизирующего излучения на белки. История открытия явления ЭПР

Усилитель Записывающее устройство Аттенюатор Микроволновой источник (клистрон) Микроволновой резонатор Детектор Образец Двойной Т-мост Магнит Катушка модулирующая поле ЭПР спектрометр

В Казанском ГУ

Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР

Прибор Завойского для измерения ЭПР

Как получить сигнал ЭПР ? Поглощение электромагнитных волн в радиоспектрометре ЭПР можно определять двумя способами: H = const поглощение h = g H 1 - При постоянном магнитном поле, мы можем изменять частоту излучения. Максимальное поглощение будет наблюдаться при резонансе, когда h = g H При этом ожидаемый спектр будет таким: 2 - По техническим причинам мы поступаем по другому: мы используем микроволновое излучение при постоянной частоте волн и изменяем магнитное поле. = const H поглощение h = g H

Что такое сигнал ЭПР ? = const H поглощение h = g H Кроме того, в результате усиления сигнала ЭПР (путем его модуляции) мы получаем не поглощение A, а - первую производную поглощения по полю dA/dH. dA/dH H h = g H Вот это мы называем сигналом ЭПР

Часть 2. Спектры ЭПР Электронный Парамагнитный Резонанс

77 K 300 K УФ облученный цистеин Примеры сигналов ЭПР g=4,3 g=2,25 Нитрозильные комплексы g=2,03 g=1,94 Fe-S белки Цитохром P-450 Метгемоглобин Радикалы аскорбата Печень крысы при 77 K g=2,00

Основные характеристики сигнала ЭПР 1) амплитуда сигнала 2) ширина сигнала ( H pp ) 3) g-фактор 4) сверхтонкая структура

Амплитуда сигнала ЭПР C = C s (S / S S ) Площадь S под линией поглощения прямо пропорциональна концентрации пара- магнитных частиц в измеряемом образце (C). где k - коэффициент зависящий от условий измерения. C = k*S dA/dH H H A S Второй интеграл-это площадь (S) под кривой поглощения (т.е. это число) сигнал ЭПР кривая поглощения площадь под кривой поглощения Амплитуда сигнала ЭПР зависит от количества поглощающих частиц и пропорциональна площади под кривой поглощения, т.е. второму интегралу от сигнала ЭПР. Практически получить значения S нетрудно. Существенно труднее найти величину k. Поэтому на практике при вычислении С обычно пользуются сравнением площади измеряемого образца S (концентрацию которого надо найти) с площадью эталонного образца S e (концентрация C e которого известна). А

Ширина сигнала ЭПР где t - время измерения и E - неопределенность энергии системы. Ширина сигнала ЭПР определяется взаимодействием магнитных моментов электрона с окружением. Теоретически минимальная ширина линии следует из соотношения неопределенностей Гейзенберга: Рассматриваемый процесс - это поглощение электромагнитного кванта, такое, что t может быть интерпретировано как время нахождения электрона на верхнем энергетическом уровне (время релаксации T ), а E как энергия системы нашем случае = g H, отсюда H gT h 2 g 1 * H dA/dH

Спин-решеточная релаксация (T 1 ) обусловлена взаимодействием магнитного момента электрона с решеткой (т.е. средой в которой находятся парамагнитные частицы). Время релаксации Процесс релаксации характеризуется временем релаксации. Время релаксации (т.е. время нахождения электрона в состоянии с большей энергией) зависит от двух процессов: спин-решеточной и спин-спиновой релаксации. время релаксации Релаксация - процесс восстановления заселенности энергетических уровней после поглощения кванта электромагнитного излучения. Спин-спиновая релаксация (Т 2 ) Обусловлена взаимодействием– с другими парамагнитными частицами (т.е. спинами)

Большое T Малое H Малое T Большое H H T h 2 g 1 * Комплексы металлов - T 1 =1 нс H=10 мТ Свободные радикалы - T 1 =0,1 мс H=100 мкТ Зависимость суммарного времени релаксации (Т) от Т 1 и Т 2 выражается формулой: Тогда выражение для ширины сигнала ЭПР будет выглядеть так:

2. Взаимодействие спинового магнитного момента электрона с орбитальным магнитным моментом электрона приводит к уширению сигнала в результате анизотропии g-фактора 3. Взаимное превращение форм радикала вызывает динамическое уширение сигнала R1R1 R2R2 4. Соударение радикала с другим радикалом или парамагнитным ионом лежит в основе уширения за счет спинового обмена Механизмы уширения сигнала ЭПР : 1. Взаимодействие магнитных моментов двух парамагнитных частиц (радикалов или ионов) приводит к уширению по диполь- дипольному механизму

g-фактор g-фактор сигнала ЭПР - это не только параметр, отражающий вклад орбитального и спинового моментов в суммарный магнитный момент, но и характеристика, показывающая положение сигнала ЭПР во всем диапазоне магнитного поля. g=4,3 g=2,25 g=1,94 Fe-S белки Цитохром P-450 Метгемоглобин Радикалы аскорбата g=2,00 увеличение H увеличение g Из основного уравнения резонанса следует, что при =const Следовательно, при увеличении H происходит снижение g, и наоборот. Однако, величину Н нельзя считать характеристикой сигнала ЭПР, т.к. при изменении резонанс будет происходить уже при других значениях Н. Величина g не изменяется при изменении Н (т.е. она инвариантна от метода измерения), и поэтому g-фактор - характеристика сигнала ЭПР.

Сверхтонкое взаимодействие Взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с магнитным моментом ядра соседнего атома (например, H или N) называется сверхтонким взаимодействием и приводит к появлению сверхтонкой структуры сигнала ЭПР H H3C OH электрон протон S = ±1/2. Протон имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (H o ) в двух направлениях (вдоль и поперек поля) т.к. подобно электрону, имеет спиновое число S = ±1/2. H0 протоны Магнитный момент протона создает магнитное поле (+H p или –H p, зависящее от ориентации протона), которое складывается с внешним магнитным полем (Н 0 ). H0 H 0 - H p H 0 + H p протон электрон Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H 0 + H p )(если спин протона=1/2) или немного меньше (H 0 - H p ), чем в отсутствии протона (H 0 ) (если спин протона=-1/2). В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из двух линий Hp Hp Расстояние между линиями будет зависеть от величины магнитного поля создаваемого протоном в месте нахождения неспаренного электрона, которое в свою очередь зависит от расстояния между электроном и протоном

Сверхтонкая структура Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к двум протонам, как в радикале этанола (. CH 2 -CH 2 -OH ) H HC OH H H электрон протон Магнитное поле вокруг неспаренного электрона теперь может иметь следующие значения: H 0 + H p1 + H p2 = H 0 + 2H p H 0 + H p1 - H p2 = H 0 H 0 – H p1 + H p2 = H 0 H 0 – H p1 - H p2 = H 0 - 2H p Как результат, сигнал ЭПР радикала расщепляется на 3 линии 2H p Состояние Н=Н 0 реализуется двумя способами (а Н=Н 0 +2Н р или Н=Н 0 -2Н р только одним), следова-тельно вероятность этого состо-яния (и интенсивность сигнала) будут вдвое больше. Расстояние между линиями (в данном случае 2Н р ) является основной характеристикой взаимодействия неспаренного электрона с магнитным ядром. Эта величина называется, также, константой сверхтонкого взаимодействия. В конечном итоге вместо одного сигнала будет три с соотношением интенсивностей 1:2:1

Сверхтонкое взаимодействие (продолжение) N=O H3C СH электрон протон S = ±1 и 0. Атом азота имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (H o ) в трех направлениях (вдоль поля, против поля и «поперек» поля) имеет спиновое число S = ±1 и 0. Магнитный момент азота создает магнитное поле (+H p или –H p, и Н=0), которое складывается с внешним магнитным полем (Н 0 ). H 0 +0 H 0 - H p H 0 + H p азот электрон Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H 0 + H p )(если спин азота=1) или немного меньше (H 0 - H p ), чем в отсутствии азота (H 0 ) (если спин азота=-1), либо не изменяется, если спин =0. В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из трех линий Hp Hp H0 атомы азота

Часть 3. Практическое применение в медико-биологических исследованиях Электронный Парамагнитный Резонанс

Применение ЭПР в медико- биологических исследованиях: 1.естественные сигналы ЭПР 2.метод спиновых меток и зондов 3.метод спиновых ловушек

Применение ЭПР в медико- биологических исследованиях: 1.естественные сигналы ЭПР 2.метод спиновых меток и зондов 3.метод спиновых ловушек

Если взглянуть на спектр ЭПР, например, печени крысы, то можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, сигнал метгемоглобина и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов. Благодаря коротким временам релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота (77 К). 100 Гс g=4,3 g=2,25g=2,03 g=2,00 g=1,94 Fe-S белки цитохром Р-450 метгемоглобин свободные радикалы Спектр ЭПР печени крысы

Радикал аскорбата аскорбат радикал аскорбата дегидроаскорбат Сигнал ЭПР радикала аскорбата можно наблюдать непосредственно в крови или плазме. Добавление пероксидазы приводит к увеличению сигнала ЭПР и последуюему его исчезновению. Длитель- ность кинетики пропорци- ональна концентрации аскорбата в крови. 5 Гс 2 мин + пероксидаза

77 K 300 K Спектр ЭПР облученного УФ светом цистеина Повысить концентрацию свободных радикалов, для избежания трудностей при их изучении, можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения (УФ или ионизирующей радиацией) биологических объектов находящихся при низкой температуре. Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах h

Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов семихинонный радикал убихинона Q 10 феноксильный радикал -токоферола семихинонный радикал -токоферола

Применение ЭПР в медико- биологических исследованиях: 1.естественные сигналы ЭПР 2.метод спиновых меток и зондов 3.метод спиновых ловушек

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин, равный ±1 или 0. 2 H C H 3 C H 3 C C C 2 H CH 2 N C CH 3 CH 3 O. Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО). Метод спиновых зондов

Время корреляции c Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым. Это движение можно охарактеризовать временем корреляции ( с ): При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент. 10 Gs s s s s s I (+1) I (0) I (-1) H (-1) H (+1) H (0) Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных с где H +1 - ширина низкопольной компаненты I +1 - амплитуда низкопольной компаненты I -1 - амплитуда высокопольной компаненты

Используя уравнение Стокса-Эйнштейна можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе где R - эффективный радиус нитроксильного радикала. T – абсолютная температура - время корреляции - вязкость Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран. Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с микровязкостью среды

Представленные спектры ЭПР отражают поведение зонда ТЕМПО в средах с различной гидрофобностью. Определив отношения a / (a + b) или (a / c) в этом спектре, можно посчитать параметр гидрофобности f, показывающий сколько и в какой фракции мембраны содержится зонда. Параметр f удобен при изучении процессов перекисного окисления в мембранах. ab ca f = a+b a c Параметр гидрофобности f 10 Gs

Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита При анизотропном вращении стеариновой кислоты вокруг длинной оси сигнал ЭПР будет сильно зависеть от степени анизотропии вращения, который количественно характкризуется так называемым параметром упорядоченности S Определить параметр упорядоченности S, можно измерив константы сверхтонкого расщепления – А || и А и подставив их значения в формулу 10 Gs 2A || 2A

Параметр упорядоченности S равен 1, есливращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны. В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1. В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР. Параметр упорядоченности и вязкость мембраны

S=0.2; =72.2 o S=1.0; =0 o S=0.8; =30.7 o S=0.6; =45.2 o S=0.4; =58.3 o S=0; =90 o Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения конуса вращения

Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты С-5 С-9 С-12 С-16

pH=7.0 pH=4.95 pH=4.4 pH=2.0 g= IR I RH + 10 Gs Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН Казалось бы, что измерение рН достаточно легко и точно можно проводить с помощью рН- электродов, однако очень трудно если не невозможно измерить рН внутри лизосомы или фагоцитирующего лейкоцита. Для этих целей и применяют рН- чувствительные спиновые зонды. В основе метода рН- чувствительных зондов лежит способность зонда давать отличные друг от друга спектры ЭПР в протонированной и депротонированной формах. Таким образом, существует узкий диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР зонда.

pK pH aN f a N =(a N R + a N RH + )/2 Зависимость параметра f и a N от рН f =(I R ) / (I R + I RH+ ) a N R и a N RH + константы СТВ радикалов R и RH+ I R и I RH+ амплитуды сигналов ЭПРрадикалов R и RH+

Спектр ЭПР нативного химотрипсина, помеченного спиновой меткой. I1 I0 Денатурация белка приводит к увеличению подвижности полипептидных цепей и соответственно увеличению подвижности спиновой метки. Соотношение величин I 0 и I 1 используется для количественной характеристики подвижности спиновой метки. Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой 10Gs

В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной молекулой или макромолекулой. 3. Глубинный участок Метка Белок 1. Водная фаза 2. Поверхностный слой Метка Спектры ЭПР спиновой метки при взаимодействии с SH-группами белка

20 Gs + O 2 - O 2 Fe 3+ Fe 2+ O2 O2 R- O2 O2 Fe 3+ Fe 2+ R- a b Аллостерические эффекты в гемоглобине, меченым иминоксольным радикалом в геминовой группе при 25C. a - спектры ЭПР, b - путь включения метки в -цепи гемоглобина и присоединение О 2 к геминовой группе в - цепях. R - spin labels. Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине

Применение ЭПР в медико- биологических исследованиях: 1.естественные сигналы ЭПР 2.метод спиновых меток и зондов 3.метод спиновых ловушек

Основы метода спиновых ловушек (spin trapping assay) Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях не превышает 10 нМ. Минимальная концентрация свободных радикалов, которую можно обнаружить методом ЭПР 100 нМ R + ST SA Предложен в независимо Konaka T. (Япония), R. Lagercranz (Швеция) и E. Janzen (Канада).

Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов -фенил-N-трет-бутил нитрон (PBN) PBN спиновый аддукт aN a H H pp

Основные виды спиновых ловушек нитрозосоединения нитроны Нитронил- нитроксилы PBN DMPO нитрозобензол трет-нитрозобутан DEPMPO NNR

Основные требования к спиновым ловушкам Быстрые реакции с радикалами Отсутствие побочных реакций Образование стабильных аддуктов Отличие в параметрах спектра ЭПР спиновых аддуктов у разных радикалов

Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов Радикал Константа скоросмти Р-ритель aN a H H pp R 3 -C4.3*10 7 вода R-O1.2*10 8 вода R-OO4.0*10 2 вода OH 8.5*10 9 вода O 2 5.0*10 8 вода

Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов Если известны: (1) тип СЛ, (2) Р-ритель, (3) a N (мТ) и (4) a H (мТ) СА можно легко идентифицировать в базе данных спектров ЭПР. DMPO aqueous 1.49 OH; Morgan D.D. et. al., Photochem. Photobiol. 1985, v. 42, p OH; Thornalley P.J. et al., Biochem. Biophys. Acta 1985, v. 827, p OH; Makino K. et al., Biochim. Biophys. Res. Commun. 1986, v. 141, p OH; Minotti G. et al., J. Biol. Chem. 1987, v. 262, p

Рекомендумая литература: 1.Дж. Вертц и Дж. Болтон Теория и практические приложения метода ЭПР. Мир, Москва, Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. Под редакцией А.Б. Рубина. Высшая школа, Москва, Метод спиновых Меток. Теория и применение. Под редакцией Л. Берлинера. Мир, Москва, Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. Наука, Москва, Зубарев В.Е. Метод спиновых ловушек. Издательство МГУ, Москва, 1984.