ПОДГОТОВИЛ: СТУДЕНТ ГР ХАЛМУМИНОВ Н.Д ПРОВЕРИЛ КАРАГАНДИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ КАФЕДРА ОБЩЕЙ ИММУНОЛОГИИ И АЛЛЕРГОЛОГИИ СРС на тему: Моноклональные антитела. Гибридомная технология. Основные области применения МКАТ в иммунологии

Моноклональные антитела антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на - mab (от английского «monoclonal antibody»). Примерами лекарственных средств на основе моноклональных антител являются ипилимумаб (Ервой), использующийся для лечения меланомы, трастузумаб (Герцептин), применяющийся в лечении рака молочной железы и ритуксимаб, показавший свою эффективность против хронического лимфолейкоза.

Синтез моноклональных антител осуществляется после дифиринцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки

История открытия Ещё в начале XX века Пауль Эрлих постулировал, что если бы мог быть выработан компонент, способный селективно связывать организм, вызывающий заболевание, то вместе с этим компонентом к патогенному организму мог бы быть доставлен токсин. В 1970-е годы уже были известны опухолевые B-лимфоциты(клетки миеломы), которые синтезировали один и тот же тип антител (парапротеин). Эти клеточные культуры использовались для изучения строения молекулы антитела, но не было методики, позволявшей продуцировать идентичное антитело к заданному антигену. Процесс получения моноклональных антител был изобретён Жоржем Кёлером и Сезаром Мильштейном в 1975 году. [ За это изобретение в 1984 году они получили Нобелевскую премию по физиологии. Идея состояла в том, чтобы взять линию миеломных клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела и слить такую клетку с нормальным B-лимфоцитом, синтезирующим антитела, с тем, чтобы после слияния отобрать образовавшиеся гибридные клетки, синтезирующие нужное антитело. Эта идея была успешно реализована и уже к началу 1980-х годов началось коммерческое получение различных гибридом и очистка антител против заданных антигенов. Однако, так как лимфоциты были мышиные и синтезировали мышиный ммуноглобулин, введение таких моноклональных антител человеку вызывало иммунную реакцию отторжения. В 1988 Грег Винтер разработал специальную методику гуманизации моноклональных антител, что в основном снимало проблему иммунного ответа на введение антител больному с терапевтическими или диагностическими целями. Антитела, в которых некоторая часть белков заменялась белковыми компонентами человека, получили название химерных антител.

Определенный прорыв в экспериментальной и клинической работе произошел в 70-х годах XX в., когда был разработан способ получения моноклональных антител на основе гибридомной технологии. Моноклональные антитела (МАТ) являются продуктом одного из множества клонов антителообразующих клеток (АОК) и обладают строгой специфичностью по отношению к конкретной антигенной детерминанте (эпитопу) того или иного антигена. В этом отношении МАТ можно отнести к категории химически чистых реагентов.

Схема взаимодействия антитела с антигеном

Разработка технологии получения МАТ связана с именами немецкого иммунолога Г. Келера и англичанина Ц. Милыптейна. В основе метода лежит принцип получения неограниченно долго живущего клона клеток, продуцирующего антитела узкой специфичности. Этого удалось добиться с помощью соматической гибридизации плазмоцитом (ПЦ) с АОК в условиях специально разработанной селективной среды. Схема получения МАТ выглядит следующим образом. Животных (мышей, крыс) иммунизируют каким-либо антигеном (напомним, что белковые, полисахаридные, клеточные антигены имеют несколько самостоятельных антигенных детерминант эпи- топов). От проиммунизированных животных получают смесь клеток селезенки или лимфатических узлов, содержащих АОК. Полученные клетки гибридизируют с клетками плазмоцитомы с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). В данном случае плазмоцитома не должна продуцировать собственные иммуноглобулины и обладать резервным путем синтеза нуклеотидов при использовании аминоптерина (А) противоопухолевого препарата, являющегося ингибитором нуклеинового обмена. В результате предварительной селекции такие плазмоцитомы удалось получить.

Обычно клетки при применении аминоптерина включают резервный путь синтеза нуклеиновых кислот, используя продукты промежуточного обмена гипоксантин (Г) и тимидин (Т), и таким образом смягчают действие ингибитора. Учитывая все эти особенности, авторы разработали селективную среду, получившую название ГАТ (по первым буквам названия основных компонентов). В результате прошедшего слияния клеток в культуральной среде присутствуют несколько типов гибридов (АОКхАОК, АОКхПЦ, ПЦхПЦ), а также не вступившие в процесс гибридизации натив-ные АОК и ПЦ. Полученную смесь культивируют в ГАТ-среде. Через несколько дней культивирования АОК погибают естественным образом в силу ограниченной продолжительности жизни. ПЦ, не имеющие резервного пути синтеза нуклеотидов, гибнут подвлиянием ингибитора А. Остаются только гибридомы АОКхПЦ, характеризующиеся неограниченным ростом от ПЦ и синтезом антител одной определенной специфичности от АОК. Поскольку в гибридизацию с ПЦ вступает несколько клонов АОК, каждый из которых продуцирует разные по специфичности антитела, требуется дополнительная селекция разделение смеси клонов на отдельные индивидуальные клоны, продуцирующие антитела одной определенной специфичности, что и делается на заключительном этапе работы. Прошедшая селекцию гибридома источник неограниченного количества строго специфических антител.

Моноклональные антитела нашли самое широкое применение в экспериментальной работе не только у иммунологов, но и убиологов вообще. Они являются наиболее четким инструментом поиска самых различных молекулярных структур клеток и тканей. Так, например, именно с их помощью выявлена и продолжает изучаться молекулярная характеристика по CD-антигенам клеток иммунной системы. С помощью меченых моноклональных антител уточняются процессы дифференцировки иммунологически значимых клеток, их относительного участия в различных функциональных проявлениях, выясняется связь клеток иммунитета с клетками иных систем организма.

В медицинской практике наибольшее применение моноклональные антитела нашли в онкологии. С помощью меченых антител определяются метастазы различных форм опухолевого поражения для выработки наиболее адекватной терапии. Во всем мире ведутся обширные исследования в области использования моноклональных антител в качестве вектора, доставляющие фармакологические, токсические препараты в пораженные раковые и другие патологически измененные клетки. У нас в стране наиболее активно в этом направлении работает С.Г.Егорова (МГУ). Вклад Г.Келлера и Ц.Милыптейна в разработку технологии получения МАТ оценен присуждением им в 1984 г. Нобелевской премии по медицине.

В чем коротко суть технологии получения моноклональных антител. Известно, что после иммунизации животного (как правило, это инбредные лабораторные мыши) в их селезенке содержатся В-лимфоциты, специфически отреагировавшие на все антигенные детерминанты, т.е. на каждую антигенную детерминанту – свой В-лимфоцит. Заслуга авторов Нобелевской премии, по сути дела, заключалась в идее создать из двух клеток – одну, но бессмертную. Они взяли из селезенки иммунизированной мыши В-лимфоцит и с помощью специальной технологии соединили его с миеломной клеткой. Получилась новая клетка, которая от В-лимфоцита взяла специфичность по отношению к конкретной антигенной детерминанте, а от миелоидной клетки – бессмертие и способность продуцировать иммуноглобулин одного класса. Такая клетка получила название – гибридома. Ее можно помещать в организм мыши, где она превратится в опухоль, продуцирующую моноклональные антитела, накапливающиеся в асцитной жидкости; или содержать в условиях культуры клеток in vitro, нарабатывая нужное количество моноклональных антител. В последующем такие моноклональные антитела подвергаются очистке различными методами и используются либо как диагностический инструмент, либо в виде фармпрепарата.

Говоря о фармпрепаратах на основе моноклональных антител, следует вспомнить еще несколько терминов. Полученное с помощью гибридомы моноклональное антитело является мышиным (как правило) иммуноглобулином и при введении в организм человека вызовет иммунный ответ против себя. Это приведет к тому, что при последующих введениях такого фармпрепарата, его эффективность буде нейтрализована антителами против него с развитием возможных побочных эффектов (вплоть до угрожающих жизни). Выход из положения был найден с помощью рекомби-нантных технологий. Вначале получили т.н. химерное моноклональное антитело. Известно, что специфичность иммуноглобулинов связана с F(ab)2 фрагментом. Взяв F(ab)2 фрагмент от мышиного моноклонального антитела и соединив его с Fс-фрагментом человеческого иммуноглобулина получили химерное моноклональное антитело, которое было уже ближе к человеческому организму, но все же продолжало вызывать иммунный ответ на себя. Следующий шаг в разработке фармпрепаратов на основе моноклональных антител был связан с созданием т.н. гуманизированных моноклональных антител, на 90% гомологичных человеческому иммуноглобулину. От первоначального гибридомного мышиного моноклонального антитела осталась лишь небольшая часть F(ab)2 фрагментов, отвечающих за специфическое связывание (гипервариабельные регионы). Фармпрепараты на осн ове гуманизированных моноклональных антител высокоспецифичны, фактически не иммуногены и обладают высоким профилем безопасности.

Общая схема получения моноклональных клеток

Заключение: Моноклональные антитела тем и отличаются от поликлональных, что они принадлежат к одному классу иммуноглобулинов (как правило, IgG) и что по специфичности своей они направлены против одной единственной детерминанты конкретного сложного антигена. Образно говоря, если организм представить стогом сена, а чужеродный микроб с характерной для него антигенной детерминантой – иголкой, то обнаружить эту иголку с помощью моноклонального антитела не составляет трудностей.