Плазмида – внехромосомный генетический элемент встречающийся во множестве видов бактерий. П. – это двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК размером от 1 до 200 тысяч пар оснований. Плазмиды Клонирование ДНК

Плазмиды содержат гены: 1. Устойчивости к антибиотикам; 2. Синтеза антибиотиков; 3. Расщепления сложных органических соединений; 4. Образования колицинов (летальные изменения мембран); 5. Образования энтеротоксинов; 6. Образования ферментов рестрикции и модификации (рестриктазы+метилазы). ген 1 ген n

Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) Р. – ферменты вносящие в ДНК двуцепочечный разрыв с образованием выступающих липких концов. Разрыв вносится по определенным последовательностям- палиндромам. HindIII 5-AAGCTT-3 Haemophilus influenzae Rd 3-TTCGAA-5 геном закончен в 1995 г. EcoRI GAATTC Escherichia coli BamHI GGATCC Bacillus amyloliquefaciens H PstI CTGCAG Providencia stuartii

М. – присоединяют метильную группу к ДНК, т.е. модифицируют ее, причем по определенным последовательностям. Модифицированная ДНК не гидролизуется рестриктазами. Таким образом бактерия защищает свою ДНК от собственных рестриктаз, но не от чужих, т.к. чужие рестриктазы могут узнавать неметилированные последовательности. Метилазы

ген устойчивости к антибиотику A Origin репликации Последовательнсти, распознаваемые какой- то эндонуклеазой рестрикции (сайты), например EcoRI Клонирование ДНК Фрагмент ДНК, содержащий ген, который мы собираемся клонировать Ген Х Сайты для EcoRI EcoRI Ген Х Ori ArAr ArAr лигаза Ген Х Гидролиз и лигирование (сшивка) ДНК

Клонирование ДНК Трансформация E. coli, селекция клонов Плазмиды с геном Х E.coli Электрический разряд ~2000 V, 5 ms Чашка Петри с селективной средой: агар+антибиотик А Размножаются только те бактерии, которые содержат плазмиду с геном устойчивости к антибиотику