Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке. Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные возможности определения структуры и функции нуклеиновых кислот. Геномные манипуляции и технологии искусственного синтеза геномов. Матричный и безматричный синтез ДНК. Методы геномной трансплантации.

Секвенирование I I II III Выделение геномной ДНК и создание библиотеки фрагментов. Сборка Аннотация и анализ

Достижения Многократная случайная фрагментация (Shotgun) Фрагмент ДНК

Создание библиотеки

Многократная случайная фрагментация (Shotgun) Фрагмент ДНК ~500 нп

Sanger Method: Generating Read 1.Start at primer (restriction site) 2.Grow DNA chain 3.Include ddNTPs 4.Stops reaction at all possible points 5.Separate products by length, using gel electrophoresis

Automatic DNA sequencing

Electrophoresis Diagrams

Использованные программы Phred ( - обработка хроматограмм LUCY ( – удаление концов вектора, оценка качества прочтений TIGR ( - сборка BAMBUS ( - взаимная ориентация контигов (построение скаффолдов)

Информационные проблемы 1 запуск до 100 гбп нуклеотидов – 10 терра байт данных – стоимость хранения до 10 тыс руб. – скорость передачи от часов При увеличении скорости оборудования на порядок – мы приближаемся к предельной скорости передачи данных и критической стоимости обработки информации Обработка данных 1 запуска сиквенатора – зачастую требует до запусков алгоритмов расчета. Стоимость вычислительных мощностей приближается к стоимости оборудования (но реактивы отсутствуют для компьютеров)

Молекулярные колонии

Системы второго поколения Genome sequencer 20/FLX Solexa 1G SOLiD system Polonator G.007

Системы третьего поколения без амплификационные (Single-molecular sequencing Методы второго поколения, использующие ПЦР, могут выдавать ошибки, вызванные амплификацией. SMS (Single-molecular sequencing) – новое поколение методов.

454 пиросеквенирование Амплификация в водно-масляной эмульсии Детекция во время синтеза – флуоресценция при отщеплении пирофосфата

454 пиросеквенирование – подготовка библиотеки Фрагментация геномной ДНК Получение тупых концов Пришивка адаптеров Получение одноцепочечной ДНК

454 пиросеквенирование – амплификация Библиотека фрагментов ДНКИммобилизация на бусинах Приготовление водно- масляной эмульсии ПЦР в эмульсии Получение одноцепочечной ДНК

454 пиросеквенирование – считывание

SOLiD & Polonator Амплификация в водно-масляной эмульсии Детекция путём лигирования

SOLiD – подготовка библиотеки

SOLiD – амплификация

SOLiD – считывание

Зонды Матрица Первый нуклеотид Второй нуклеотид

SOLiD – считывание 1. Праймирование и лигирование Сиквенсовый праймер АдаптерМатрица Лигаза 2. Детекция 3. Кэпирование Возбуждение Эмиссия

SOLiD – считывание 4. Отщепление флуоресцентной метки 5. Повторение цикла 6. Денатурация и отжиг нового праймера циклов

SOLiD – считывание 7. Повторение стадий 1-5 с новым праймером 8. Повторение цикла с последовательными праймерами Позиция Праймер Тестируемые позиции Цикл лигирования Праймерный цикл Вставка

Illumina SOLEXA Амплификация на твёрдой подложке Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой Четыре вида флуоресцентных меток Все нуклеотиды присутствуют одновременно

Illumina SOLEXA – подготовка библиотеки Адаптеры Фрагменты ДНК

Illumina SOLEXA – амплификация Считывание Фрагмент ДНК Адаптер Праймеры Адаптер Пришитые концы Свободные концы Молекулярные колонии Пришитые концы

Illumina SOLEXA – считывание Первый цикл считывания Следующий цикл считывания

Illumina SOLEXA

HeliScope Нет стадии амплификации – секвенирование индивидуальных молекул Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой Один вид флуоресцентной метки Последовательная промывка образца нуклеотидами

HeliScope Поли-А адаптерСеквенируемый фрагмент Поли-Т адаптер Детекция включения нуклеотидов Подложка

HeliScope A G C T Детекция флуоресценции Промывка dNTP Подложка

Новые методы секвенирования Метод амплификации Метод считывания 454ПЦР в эмульсииСинтез SOLiD & Polonator ПЦР в эмульсииЛигирование SOLEXA ПЦР на твёрдом субстрате Синтез HeliScopeНетСинтез

Методы нанопорового секвенирования

RNA-seq

"Reads"

Квантификация экспресии

Оборудование нового поколения для секвенирования ДНК в России Название учрежденияПлатформа РНЦ «Курчатовский институт», Москва Illumina GA IIx (×3) Applied Biosystems SOLiD 4 (×2) НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Applied Biosystems SOLiD 4 454/Roche FLX Titanium Инновационно-технологический центр «Биологически активные соединения и их применение» РАН, Москва llumina GA IIx Институт общей генетики им Н. И. Вавилова, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 llumina HiSeq 2000 Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва llumina GA IIx Генаналитика, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 Секретная станция переливания крови, Киров 454/Roche FLX Titanium Лимнологический институт СО РАН, Иркутск 454/Roche FLX Titanium Центр «Биоинженерия» РАН, Москва 454/Roche FLX Titanium НИИ физико-химической медицины, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва Applied Biosystems SOLiD 4

Синтез генома de novo

Химический синтез генома

Creating Bacterial Strains from Genomes That Have Been Cloned and Engineered in Yeast

Создание бактерии с химически-синтезированным геномом

Клетка элементарная единица строения и жизнедеятельности всех живых организмов Самостоятельное существование Самовоспроизведение Развитие Обмен веществ и энергии Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome Daniel G. Gibson, et al. Science 329, 52 (2010) Бактерии с химически синтезированным геномом быстро размножаются и внешне практически не отличаются от «диких» бактерий Mycoplasma mycoides.

Metabolic reconstruction of a minimal cell

Proteogenomics Sequencing New paradigm in genomic and proteomic research Annotation Proteomics

Draft genome Complete genome Library generation Sequencing Variety of MS/MS Reannotation Assembly and Annotation