Гибридный белок: люцифераза Luciola mingrelica – биотин- связывающий домен. Получение, свойства, применение Смирнова Д.В., Кокшаров М.И., Угарова Н.Н. Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва С Введение В настоящее время актуальной задачей является создание новых биоаналитических высокочув- ствительных и высокоспецифичных реагентов для определения нано количеств различных физиологически активных веществ и патогенных микроорганизмов. Одним из широко развиваемых путей получения таких систем является использование гибридных белков, совмещающих в себе высокую чувствительность белка- детектора с высокой селективностью белка, способного связываться с изучаемой мишенью. В результате чего происходит фиксация белка-детектора на поверхности мишени. В качестве белка детектора могут выступать различные люциферазы, в частности люцифераза светляков, обладающая высокой чувствительностью вследствие высокого квантового выхода биолюминесцентной реакции, низким фоновым сигналом, который определяется стабильностью субстрата, а так же простой процедурой наработки и выделения белка в необходимых количествах. В качестве селективного компонента могут быть использованы. стрептавидин или биотин-связывающий домен, имеющие высокую константу связывания. Биотинилирование люциферазы возможно при гибридизации фермента с биотин связывающими доменами. Биотин связывающие домены содержатся в таких белках, как ацетилкокарбоксилаза и пируваткарбоксилаза, имеющих в активном центре остаток лизина, способный образовывать амидную связь с биотином при помощи биотин-лигазы [1]. Таким образом, биотинилирование белков, коньюгированных с биотин-связывающими доменами происходит непосредственно при синтезе гибридных белков, in vivo. В литературе подобные белки описаны для люцифераз светляков Photinus pyralis [2-3] и Luciola lateralis [4-5]. Для люциферазы светляков Luciola mingrelica таких конструкций не описано. Целями работы были: Получение и изучение свойств гибридного белка люцифераза- биотин связывающий домен для люциферазы Luciola mingrelica. Исследование возможности его применения для специфического определения содержания клеток Salmonella typhimurium. Рис. 2. Схема образования детектируемого комплекса. Таблица 1 Физико-химические свойства мутанта 4TS люциферазы cветляков Luciola mingrelica и гибридного белка: люцифераза (4TS)- биотин связывающий белок (bccp). 2. Плазмида для экспрессии гибридного белка Для получения плазмиды, кодирующей гибридный белок, были использованы три фрагмента ДНК: экспрессионный вектор pET23b, кодирующий дополнительную шестигистидиновую после- довательность ; ген термостабильного мутанта люциферазы 4TS, выделенный из плазмиды методом рестрикции; фрагмент ДНК, кодирующий биотинсвязывающий домен (87 С-концевых аминоксилотных остатков bccp), выделенный из генома клеток E. coli и модифицированный сайтами рестрикции Sal I и Apa I при помощи ПЦР. Полученные в результате лигирования клоны были проверены на содержание необходимых фрагментов с использованием метода PCR, рестрикционного анализа и секвенирования, которые подтвердили отсутствие мутаций в гене, кодирующем гибридный белок. Полученная плазмида была наработана в клетках E. coli XL1blue. 3. Исследование свойств luc- bccp Экспрессией белка в клетках E. coli BL21(DE3) получен и выделен с использованием метода метало- хелатной хроматографии гибридный белок (4TS- bccp), причем 60% гибридного белка находится в биотинилированной форме. Изучены каталитические свойства, термостабильность и спектры биолюминесценции гибридного белка и показано, что они близки к свойствам исходной люциферазы (Таблица 1). 4. Выводы 1.Сконструирована плазмида, кодирующая гибридный белок «люцифераза» -«биотин-связывающий домен» (4TS- bccp87) с использованием гена термостабильного мутанта 4TS люциферазы светляков Luciola mingrelica. 2.Проведена наработка, выделение и очистка гибридного белка luc-bccp87. Показано, что степень биотинилирования гибридного белка составляет 60%. 3.Показано, что присоединение биотин-связывающего домена не оказывает cущественного влияния на константы Михаэлиса, термостабильность и спектры биолюминесценции люциферазы светляков L. mingrelica. 4.Оптимизированы условия получения комплекса гибридный белок-стрептавидин для проведения иммуноферментного анализа. Показано, что стрептавидин и используемые антитела не оказывают влияния на биолюминесцентную активность гибридного белка. 5.Показана возможность детекции инактивированных клеток Salmonella typhimurium с использованием моноклональных антител и комплекса гибридный белок-стрептавидин в интервале КОЕ/мл. Ссылки 1.Chapman-Smith A., Cronan J. E. // Journal of Nutrition P Karp M., Oker-Blom C. // Biomolecular Engineering P Wang C.-Y., Sam Hitz, Andrade J. D., Stewart R. J. // Anal. Biochem P Ohkuma H., Abeb K., Kosakab Y., Maedaa M. // Analytica Chimica Acta P Tatsumi H., Fukuda S., Kikuchi M., Koyama Y. // Anal. Biochem P Дополнительная информация Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект а). 4. Использование гибридного белка в качестве метки в ИФА для определения количества клеток Salmonella typhimurium В предварительно оптимизированных условиях был проведен гетерогенный сэндвич анализ для определения термически инактивированных клеток сальмонеллы (рис 2.). Иммобилизацию препарата инактивированных клеток проводили на активированный моноклональными небиотинилированными антителами полистирольный планшет. Рис. 4. Градуировочная зависимость биолюминес- центного сигнала от логарифма концентрации клеток Salmonella typhimurium в анализируемом образце, полученная с использованием схемы детекции, показанной на рис.2. Фермент K m, мкМ Максимум спектра биолюминес- ценции, нм Время полуинакти- вации при 47 о, мин LH 2 АТФpH 7.8 4TS60 ± 541 ± ± 2 4TS-bccp66 ± 641 ± ± 2