Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена K-Ras мыши, связанных с развитием рака легких Горшкова Елена Вячеславовна

Схема гена K-Ras 1 kb E 0 E 1 E 2 E 3 E 4A E 4B I 1 I 2 I 3 I 4 I 5 нетранслируемый экзон транслируемый экзон I 1 -I 5 интроны Экзон СА Чувствительные линии M.musculus Экзон GC Устойчивые линии M.musculus Экзон СС Промежуточные линии M.musculus

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ Выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне гена K-ras могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей. Выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в 12-м кодоне протоонкогена К-ras.

СА СС GC Связывание белков экстрактов ядер лёгких мышей с олигонуклеотидами, воспроизводящими "чувствительный", "промежуточный" и "устойчивый" варианты SNP СА: 5-cagtGTGCAAGAAACTCCACTTATCATGAGAGCT-3 GС: 5-cagtGTGCAAGAAAGTCCACTTCTCATGAGAGCT-3 СС: 5-cagtGTGCAAGAAACTCCACTTCTCATGAGAGCT-3

антитела к GATA-6 GATA NS конкуренты Идентификация белка, образующего основную полосу задержки

Экзон СА C --- GATA-6 Экзон СА Т Чувствительные линии M.musculus Устойчивые M.spretus

Идентификация белка связывающегося с олигонуклеотидами, воспроизводящими район полиморфизма у мышей M.musculus и M.spretus 311-MUS311-SPRET Антитела к NF-Y 50x NF-Y LKLF NF MUS

Экзон СА C --- GATA-6 Экзон СА Т Чувствительные линии M.musculus Устойчивые M.spretus NF-Y

Антитела к NF-Y Связывание белков экстрактов ядер лёгких мышей с областью потенциального композиционного элемента ICRSPRET DD ICRSPRET DD

Антитела к NF-Y 50x NF-Y Идентификация сайта для фактора NF-Y в районе СА полиморфизма

Экзон СА C --- GATA-6 Экзон СА Т Чувствительные линии M.musculus Устойчивые M.spretus NF-Y 12 кодон Экзон GC C кодон Устойчивые линии M.musculus

Идентификация белков связывающихся с областью 12 кодона гена K-Ras мыши

1111 СА C --- GATA СА Т Чувствительные линии M.musculus Устойчивые M.spretus NF-Y 12 кодон 1111 GC C Устойчивые линии M.musculus кодон

Влияние легочных канцерогенов на ДНК связывающую активность факторов GATA-6 и NF-Y и их связывание с олигонуклеотидами воспроизводящими районы 12 кодона и СА полиморфизма 12 CA GATA NF-Y SRF Чувствительные линииУстойчивые линии

Вестерн-блот гибридизация с антителами к NF-Y и GATA-6

ВЫВОДЫ 1.Показано, что SNPs в интроне 2 гена K-ras в позициях 288 п.н. и 296 п.н., сопряженные с предрасположенностью мышей вида M.musculus к пульмоноканцерогенезу, формируют комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA -6 и NF-Y. Взаимодействие GATA-6 и NF-Y с районом локализации SNPs (от 278 до 307 п.н.) носит взаимозависимый характер. 2.Мононуклеотидная замена в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-ras, отличающая чувствительные к развитию рака линии мышей вида M.musculus от мышей устойчивого вида M.spretus, приводит к ухудшению сайта транскрипционного фактора NF-Y.

3. Набор SNP C (288п.н.), A (296 п.н.) и C (311 п.н.) в интроне 2 гена K-Ras у мышей чувствительных к раку легких линий M.musculus формирует потенциальный композиционный элемент, включающий два сайта связывания NF-Y и один сайт связывания GATA-6. Мононуклеотидные замены, характерные для устойчивых линий M.musculus (G 288 п.н.и С 296 п.н) или вида M.spretus (Т 311 п.н.) элиминируют различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у M.musculus и NF-Y сайт у M.spretus 4. Район экзона 1 гена K-Ras (от 20 до 50 п.н.), включающий кодон 12 (горячую точку мутагенеза), также содержит комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.

5. Показано, что при введении легочных канцерогенов 3- метихолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) животным происходит увеличение ДНК-связывающей активности NF-Y и GATA-6, а также усиление их связывания с обоими выявленными нами GATA-6/ NF-Y комплексными сайтами в условиях in vitro. Эффект пульмоноканцерогенов наблюдается у мышей чувствительных к развитию рака легких линий ICR, GR и A/He, но не у резистентных линий C57BL и C3H/A. 6. Происходящее под действием 3-МХ и НЭМ увеличение ДНК- связывающей активности NF-Y и GATA-6 не связано с изменением концентрации транскрипционных факторов NF- Y и GATA-6 в ядерных экстрактах, что предполагает какие- то модификации этих белков.