СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ И МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК, ФИБРОБЛАСТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПЛОИДНОСТИ И СТАБИЛЬНЫХ ГИБРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ СЛИЯНИЕМ Короткевич Екатерина Юрьевна Новосибирский государственный университет Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Киселева Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН 2010 г.

Цель : выявить особенности структурной организации гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток мыши, а также сравнить строение плюрипотентных клеток мыши в условиях in vivo и in vitro. Задачи: 1.Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на ультраструктуру клеток ВКМ. 2.Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию. 3.Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками для выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток. 4.Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно- цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на строение клеток ВКМ. 2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию. 3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками с целью выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток. Зигота ЭСК ЭСК-подобный гибрид Фибробласто- подобный гибрид Бластоциста ДФМ ТФМ..?.. ВКМ...

Методы исследования: -Световая микроскопия полутонких срезов -Просвечивающая электронная микроскопия -Морфометрический анализ Клеточные культуры и ранние эмбрионы мыши: ЭСК – эмбриональные стволовые клетки (линия E14Tg2aSc4TP6.3, получена из мышей 129/Ola Mus musculus) (Pratt, 2000); ДФМ – диплоидные эмбриональные фибробласты (получены из дневных эмбрионов мышей линии DD/c Mus musculus); tDD – тетраплоидные фибробласты (получены из ДФМ); tef4 – стабильные гибридные клетки (17 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ДФМ (Круглова, 2008); tef-t8 – стабильные гибридные клетки (28 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ТФМ (Круглова, 2008); эмбрионы – получены из мышей линии 129/Ola (стадия зиготы, 2-х и 4-х клеточного зародыша, морулы, блатоцисты). Используемые в работе клеточные культуры и эмбрионы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН к.б.н., н.с. А.А. Кругловой и к.б.н., с.н.с. Е.А. Кизиловой, соответственно. Материалы и методы

Особенности организации эмбриональных стволовых клеток Я М М Яд В А Я Б Световая микроскопия Окраска метиленовым синим Электронная микроскопия 10 мкм 2 мкм50 мкм

А Я М М Б М М В ЭПР М М Особенности ультраструктурной организации митохондрий в эмбриональных стволовых клетках Впервые обнаружено, что ЭСК могут отличаться по морфологии митохондрий. В цитоплазме одних клеток присутствуют митохондрии со светлым матриксом и узкими кристами (Рис. А), в то время как цитоплазма других клеток содержит митохондрии с темным матриксом и расширенными кристами (Рис. Б). Наряду с этим встречаются клетки, в которых присутствуют оба типа митохондрий (Рис. В). Масштаб 1 мкм

Стадии раннего эмбрионального развития мыши Зигота2-кл4-кл МорулаБластоциста 20 мкм 1 мкм Д р о б л е н и е

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты ЭПР М М М М Фрагменты ЭСК Фрагменты клеток ВКМ Я Я 1 мкм 5 мкм 1 мкм Л К Ф ЭПР Ф Яд М М

Сравнительный морфологический анализ ЭСК, диплоидных фибробластов (ДФМ) и тетраплоидных фибробластов мыши (ТФМ), а также стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК с ДФМ, ЭСК с ТФМ. Эмбриональные стволовые клетки: округлая форма, крупное слегка изрезанное ядро, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР Тетраплоидные фибробласты : вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой Диплоидные фибробласты: Вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмолеммой ЭСК-подобные гибриды: округлая форма, крупное ядро, высокая изрезанность ядерной оболочки, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР Фибробластоподобные гибриды: вытянутая форма, глубокие узкие инвагинации ядерной оболочки, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой Масштаб 20 мкм

Особенности ультраструктурной организации фибробластов мыши в культуре Я М ЭПР 5 мкм 0,5 мкм Яд М ЭПР

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и гибридов, полученных слиянием ЭСК с диплоидными фибробластами Я Я М Эмбриональная стволовая клеткаЭСК-подобный гибрид Масштаб 5 мкм Яд

Сравнительный морфологический анализ фибробластов и гибридов, полученных слиянием ЭСК с тетраплоидными фибробластами Я Я Фрагмент фибробластаФрагмент фибробласто-подобного гибрида Яд Масштаб 5 мкм 29 %

Морфометрический анализ ядерно- цитоплазматического соотношения в гибридных и исходных клетках Анализ клеток на полутонких срезах проводился с использованием программы AxioVision. Ядерно-цитоплазматическое отношение – отношение площади ядра к площади всей клетки на срезе, проходящем через середину ядра. Средняя площадь клетки на срезе Средняя площадь ядра на срезе Ядерно-цитоплазматические отношения Площадь ядра, мкм 2 Площадь клетки, мкм 2 Ядерно-цитоплазматический индекс ** *

Морфометрический анализ поверхностно-объемного отношения ядер гибридных и исходных клеток Поверхностно-объемное отношение (отношение площади поверхности ядра к его объему) оценивали с помощью тестовой системы линий (открытая квадратная решетка), накладываемой случайным образом на срез клетки, проходящий через середину ядра (Груздев, А.Д.; Weible, E.R., 1969) Поверхностно-объемное отношение, мкм 2 /мкм 3 * *

Выводы 1.ЭСК существенно отличаются от клеток ВКМ бластоцисты по строению эндоплазматического ретикулума, отсутствию гранулярных и кристаллических включений, пучков фибрилл в цитоплазме и типу межклеточных контактов. В длительно культивируемых ЭКС мыши впервые обнаружен новый тип митохондрий, который не похож ни на один из многочисленных видов гетерогенной по морфологии популяции митохондрий ВКМ. 2.Тетраплоидные фибробласты сходны по ультраструктурной организации с диплоидными фибробластами и отличается от них несколько большими размерами клетки и ядра. 3.Гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, имеют сходную структурную организацию с ЭСК, тогда как гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК и тетраплоидных фибробластов, сходны по морфологии с фибробластами. Оба типа гибридов характеризуются более высокой по сравнению с исходными родительскими клетками изрезанностью ядерной оболочки, к внутренней мембране которой прикрепляется компактный гетерохроматин. 4.Сходство гибридных клеток по морфологическим и морфометрическим параметрам с ЭСК либо фибробластами скорее обусловлено плоидностью соматического партнера.