Физиологические эффекты активных форм кислорода.
Основные механизмы образования АФК. +4e + H +
Реакция Фентона
NAD(P)H-оксидазы - главные физиологические продуценты АФК в клетках сосудов. NAD(P)H-оксидаза - 4 субъединицы: цитохром b558: gp91phox и p22phox 2 цитозольных компонента: р47phox и p67phox. G-белок rac-семейства участвует в сборке активного комплекса. Точно неизвестно, какие субъединицы функционально активны для производства АФК в разных типах клеток.
АФК - внутриклет. «реостат», модулирующий активность биохимических реакций. Уровень АФК строго контролируется:
АФК как сигнальные молекулы в ГМК ANGII 5-HT TRP GPCR NAD(P)H - оксидаза Н 2 О 2 /O 2 ГипертрофияПролиферация p38MAPKERK-1/2MAPK (ANGII)5-HT
PDGF EGF RTK p21 Ras Raс активация мембран-связанного оксидазного комплекса (?гомолога gp91phox) Н 2 О 2 /O 2 Ингибирование белковой тирозин-фосфатазы Пролиферация NIH3T3-клетки (immortalized fibroblasts)
NADH-оксидаза RS/TK Src-киназы Миофибробластическая дифференцировка Первичные легочные фибробласты. TGF-β1 Регуляция актинового цитоскелета О2О2 Н2О2Н2О2
Оксидативная модификация белков как возможный механизм АФК-опосредованной передачи сигналов в клетке. ОМ белков путем окисления Cys-остатков SH P. active O 2 (H 2 O 2 ) SOH P. inactive GSH P. reversible SSG тиотрансфераза
Образование внутримолекулярных дисульфидных мостиков Р SH H2O2H2O2 SS Р Изменение активности путем конформационных изменений в структуре белка
Димеризация белков межмолекулярными дисульфидными мостиками: прямая: PK SH PK SH + неактивные мономеры H2O2H2O2 PK SS SS активный димер обратная: PK RP SH неактивный комплекс PK H2O2H2O2 + RP SSSS активная РК
Образование дитирозиновых связей: Р Y Y Y Р + H 2 O 2 / пероксидаза Металл-катализируемое окисление Fe- или Cu- содержащий Р MFO (ROS) оксидативная модификация Fe- или Cu- содержащий Р Y 2 Y 2 Y 2 Р Р
Методы изучения АФК Люцигенин - хемилюминесцентный субстрат для определения О 2 в клетке.
DCFH-DA DCFH - 2,7-дихлорфлуоресцин - нефлуоресцирующий DCF - 2,7-дихлорфлуоресцеин - флуоресцирующий
Флуориметрический метод, основанный на способности гем-пероксидаз катализировать Н 2 О 2 -зависимую димеризацию замещенных фенольных элементов. Высокая специфичность и чувствительность к Н 2 О 2. Наиболее часто используется пероксидаза хрена.
Электрон-спиновая резонансная спектроскопия - единственный аналитический метод. Метод спиновых ловушек - нитроны или нитрозосоединения.
РЕЗЮМЕ: АФК не только вредные побочные продукты клеточного метаболизма, но и важные регуляторы жизнедеятельности клетки. Уровень АФК строго контролируется Передача сигналов в клетке с помощью АФК осуществляется путем оксидативной модификаций с клеточными компонентами, такими как киназы, белки или ДНК.