Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

2. Комплексы биополимеров с лигандами. Специфические взаимодействия. Методы определения констант равновесия

Простейшая модель взаимодействия биополимера с лигандом (модель двух состояний) P + L PL (P – полимер, L – лиганд, PL – комплекс ) k асс k асс – константа скорости ассоциации, [M] -1 [t] -1 k дисс – константа скорости диссоциации, [t] -1 К асс = k асс / k дисс термодинамическая константа ассоциации, [М] -1 К дисс = 1/ К асс = k дисс / k асс термодинамическая константа диссоциации, [М] ( К дисс или К D характеризует сродство лиганда к полимеру) k дисс

P t =[P]+[PL] L t =[L]+[PL] К D ? [P]? [L]? [PL]?

Определение К асс в координатах Скечерда L b (bound) – связанный в комплекс лиганд L f (free) – свободный лиганд К асс == P t К асс - К асс L b Если полимер имеет несколько одинаковых и невзаимодействующих центров связывания n (например, в случае, когда белок состоит из нескольких идентичных субъединиц): = nP t К асс - К асс L b

При предельном количестве связанного лиганда (L b ) выражение можно записать в виде: = К асс (L b - L b ) Вместо величин L b, L b можно использовать любое свойство системы, пропорциональное концентрации комплекса. В случае реакций, катализируемых ферментами (Е), процесс превращения лиганда-субстрата (S), происходит в комплексе фермент-субстрат (ES), и выражение для скорости превращения субстрата можно написать в виде: = К асс (v - v) Если лиганд в избытке, то концентрация свободного лиганда равна полной концентрации лиганда P t, и можно записать: = К асс (L b - L b ) или L b =

метод гель-фильтрации (t разделения [мин]), метод задержки в геле, фильтрование через нитроцеллюлозные мембраны (миллипоровые фильтры) (t разделения [сек]). Методы определения констант равновесия

Определение K D в случае, когда усвободного биополимера или лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф) достаточно изменяется при комплексообразовании Определение K D в случае, когда у свободного биополимера или лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф) достаточно изменяется при комплексообразовании: Для полимера: Ф = α Р Ф Р + α PL Ф PL Для лиганда: Ф = α L Ф L + α PL Ф PL где α Р, α PL, α L – соответствующие мольные доли Ф Р или Ф L находят измерением в отсутствие второго партнера. Ф PL – находят путем измерения при избытке второго партнера: проводят серию измерений при возрастающей концентрации второго партнера до тех пор, пока зависимость измеряемой величины от концентрации этого партнера не выйдет на плато.

Если обозначить значение измеряемой величины в отсутствие второго партнера через Ф 0, а предельное значение через Ф, то для величины α PL нетрудно получить выражение: α PL = Концентрация комплекса PL находится как: P t α PL,если измеряется характеристика полимера, L t α PL, если измеряется характеристика лиганда. Ф - Ф 0

Методы определения констант равновесия Спектрофотометрические методы Закон Бугера-Ламберта-Бера А – оптическая плотность (поглощение) раствора, ε – коэффициент экстинкции, с – концентрация вещества, l – оптический путь в растворе. Оптическая плотность А=lg(I 0 /I) I 0 – интенсивность падающего света, I – интенсивность света, прошедшего через образец А=εсl

Методы определения констант равновесия Метод спектрофлуорометрии

F – суммарная флуоресценция: F = F P + F PL F P – флуоресценция полимера, не связанного с лигандом, F PL – флуоресценция полимера, связанного в комплекс, FP 0 =F P [P]+F PL (P 0 -[P]) [P]=P 0 [PL]=P 0 Константа диссоциации: K d =

Определение констант равновесия на приборах Biacore, основанное на явлении поверхностного плазмонного резонанса (ППР) В ферментативной кинетике: определение концентраций участников реакции, изучение взаимодействия типов белок-белок, белок- низкомолекулярный лиганд и белок-нуклеиновая кислота. Достоинства метода Позволяет исследовать быстро протекающие процессы, в частности кинетику ферментативных реакций Не требует мечения реагентов химическими, флуоресцентными или радиоактивными метками. Используется без сопряженных реакций или введения в систему дополнительных компонентов, облегчающих детекцию. Для определения равновесных параметров взаимодействия биомолекул не требуется разделения свободных и связанных форм. Позволяет работать с минимальным объемом образцов в пределах 10 мкл. Часть образца, не связавшаяся с поверхностью, может быть собрана во время опыта и вновь использована в дальнейшем. Связанные с детектором молекулярные комплексы можно анализировать соответствующими способами, например, масс-спектрометрическими методами.

Определение констант равновесия на приборах Biacore Принцип работы приборов Biacore Свет лазера фокусируется на сенсорной поверхности и связывание «аналита» (свободного партнера в растворе) регистрируется по изменению резонансного угла (эффект ППР).

Определение констант равновесия на приборах Biacore Изучение функций белков, механизмов молекулярного узнавания; Экспериментальная проверка компьютерных предсказаний межмолекулярных взаимодействий; Селекция антител и аптамеров; Скрининг прототипов лекарств и физиологически активных веществ; Анализ маркеров заболеваний; Определение следового количества гормонов, антибиотиков, анаболиков и др.; Анализ качества фармацевтических препаратов; Разработка диагностических тест-систем; Разработки вакцин.