Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Институт фундаментальной биологии и биотехнологии Кафедра биофизики Экспресс метод биолюминесцентного биотестирования в системе комплексного мониторинга почвенного покрова Руководители: д.б.н., профессор Кратасюк В. А. м.н.с Римацкая Н. В. Выполнила: Студентка ББ 11-03М Казанцева М. А.

В настоящее время основой мониторинга ядовитых веществ в окружающей среде являются их предельно допустимые концентрации (ПДК) в воде, воздухе, почве и продуктах питания. Превышение ПДК химических веществ в исследуемых субстратах служит лишь косвенным показателем их токсичности. Почва может быть сильнозагрязненной, но нетоксичной или слаботоксичной и, наоборот, слабозагрязненной, но сильнотоксичной. Необходимо оценивать интегральную токсичность почвы, отражающую влияние всего комплекса загрязнителей. Наиболее целесообразным методом определения интегральной токсичности почвы является биотестирование.

Цель: Исследовать возможность применения биолюминесцентного метода тестирования для оценки качества почвенного покрова Задачи: 1.Подобрать условия пробоподготовки почв для биолюминесцентного анализа. 2.Подобрать условия для биолюминесцентного анализа почвенного покрова. 3.Исследовать почвы методом биолюминисцентного ферментативного тестирования и сравнить его с другими методами. 4.Разработать методику биолюминесцентного анализа почвенного покрова.

Материалы и методы: 1.Определении смертности и изменений в плодовитости дафний (Daphnia magna Straus) при воздействии токсических веществ, присутст­вующих в исследуемой водной вытяжке, по сравнению с контрольной культурой в пробах, не со­держащих токсических веществ. Острое токсическое действие растворов отдельных химических веществ, исследуемой водной вытяжки из почв на дафний, определяется по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более дафний за 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10 %.

Материалы и методы: 2.Метод оценки токсичности по всхожести семян, по длине стеблей и корней проростков. Семена кресс-салата помешали на фильтровальную бумагу, пропитанную водной вытяжкой. Семена инкубировали в темноте при комнатной температуре. Количество проросших семян, длину побега и корень подсчитывали на первые, вторые и четвертые сутки. 3.Биотестирования по реакции хемотаксиса парамеций. Метод определения токсичности основан на установлении различий между количеством инфузорий в опытной пробе и контрольной пробе. Оценка токсичности производится путем определения функциональной активности и счета простейших в динамике с помощью оптической техники.

Материалы и методы: 4.Биолюминесцентный метод биотестирования. Биоиндикатор – биферментная биолюминесцентная система НАДН:ФМН- оксидоредуктаза –люцифераза; в качестве тест – функции : изменения интенсивности свечения этой системы относительно контрольного (остаточное свечение -Т )

Пробоподготовка: 1 Набор пробы 2 Просушивание пробы при 105 º С в течении 1 часа 3 Просеивание 4 Приготовление водной вытяжки 5 Фильтрация 6 Центрифугирование

П ОДБОР УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ Вытяжка с помощью различных растворителей Фильтрация вытяжки из почвы разными фильтрами Хранения вытяжки из почвы в различных условиях Подготовка для экспресс анализа

I o /I k Подбор условий проведения биолюминесцентного анализа FMN I o /I k C 14 I o /I k NAD H Реакционная смесь: 1.Буфер 300 мкл 2.КРАБ 5 мкл 3.С14 30 мкл 4.NAD H 100 мкл 5.Проба 50 мкл 6.FMN 7 мкл

NAD H t t FMN t C 14 Подбор условий проведения биолюминесцентного анализа

О ПИСАНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ ПРОБ ПОЧВ 4 пробы почв собранных возле территории КраЗА 4 пробы почвы с территории Ангарскго НПЗ 3 пробы почвы с побережья оз. Байкал 6 модельных токсикантов (HgSO 4, CdCl 2, K 2 CrO 4, ZnSO 4, Co(NO 3 ) 2, Pb(NO 3 ) 2 )

Биоиндикаторы биферментная биолюминесцент ная система НАДН:ФМН- оксидоредуктаза –люцифераза Daphnia magna Straus Кресс салат Paramecium caudatum тест – функции Остаточное свечение –Т, % Смертность, % Всхожесть семян, % Реакция хемотаксиса, % Почва Модельные токсиканты Почва + CdCl 2 (1.0 г/кг) CdCl 2 (0.7 г/кг) CdCl 2 (0.5 г/кг) CdCl 2 (0.3 г/кг) Почва + HgSO 4 (7.0 г/кг) 49, HgSO 4 (2.0 г/кг) 30, HgSO 4 (0.7 г/кг) Сравнительный анализ методов биотестирования Таблица 1. Влияние водной вытяжки из почвы и водной вытяжки из почвы с добавлением токсикантов на различные тест-объекты.

Результаты: Диаграмма 1. Влияние почвенной вытяжки с добавлением HgSO 4 2 гр/кг на интенсивность свечения. Диаграмма 2. Влияние почвенной вытяжки с добавлением HgSO4 7 гр/кг на интенсивность свечения.

Влияние водного раствора HgSO 4 2 гр/кг на интенсивность свечения.

Смертность, % Проба1 ч.2 ч.3 ч.24 ч.48 ч Эталонная Результаты: Таблица 3. Результаты биотестирования острой токсичности водной вытяжки из почвы по смертности цериодафний. Биферментная биолюминесцентная система Т= %

В ЫВОДЫ : 1. Подобраны оптимальные условия пробоподготовки и проведения анализа 2. Биолюминесцентная система чувствительна к вытяжкам из различных видов почв 3. Сравнительный анализ показал высокую чувствительность биферментной биолюминесцентной системы 4. Эффект разбовления HgSO 4 ???? 5. Основным параметром оценки качества почвы является остаточное свечение (Т)