Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо Лаборатория Молекулярной генетики человека НИЦ Молекулярной медицины ММА им.И.М.Сеченова
Технологические преимущества определения маркеров метилирования перед детекцией мутаций/делеций ДНК Нарушения метилирования ДНК – один из наиболее ранних процессов канцерогенеза Частоты аномального метилирования множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе Выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна Анализ метилирования одного гена технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной-тремя парами праймеров. Поиск же мутаций в одном гене требует использования до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, удовлетворительная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР.
Технологические преимущества маркеров метилирования ДНК перед детекцией маркеров экспрессии на уровне РНК Стабильность ДНК значительно выше Аномально метилированную ДНК можно детектировать в плазме крови и других биологических жидкостях (неинвазивные / низкоинвазивные тесты) Аномальное метилирование – качественный, а не количественный признак, поэтому на достоверность его определения не влияет присутствие молекул нуклеиновых кислот из нормальных тканей
Масштабный скрининг метилирования ДНК Высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза может достигаться на уровне единичных маркеров Удовлетворительная специфичность молекулярно- генетических маркеров канцерогенеза достигается только при использовании систем десятков маркеров Современные подходы к масштабному скринингу метилирования Полногеномное секвенирование метилома Скрининг дифференциального метилирования геномов
Цель: разработка современного высокотехнологичного скрининга дифференциального метилирования ДНК Анализ ранее опубликованных подходов; выбор и обоснование методической базы исследования Разработка лабораторного протокола метода скрининга дифференциального метилирования ДНК Разработка методов картирования выявляемых дифференциально метилированных локусов Проведение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы (РМЖ); характеристика нормальных и опухолевых метилотипов Картирование и характеристика частот аномального метилирования конкретных выявленных локусов при РМЖ Задачи:
Метод амплификации интерметилированных сайтов ( АИМС ) Frigola et al., 2002
Компьютерная программа PeakPick: анализ и сравнение реальных электрофореграмм
Позиционирование продуктов АИМС на капиллярной электрофореграмме 1. Секвенирование индивидуальных фрагментов 2. Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico
Полная репрезентация АИМС in vitro - CpG-метилаза M.SssI - XmaI АИМС
Позиционирование продуктов АИМС на капиллярной электрофореграмме Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico C2CD2-5-CpG Межгенный13q32.1-CpG PHF-5-CpG 12q CpG неохарактеризованные сплайсируемые РНК Рестриктаза NotI - C2CD2-5-CpG Рестриктаза AscI - PHF-5-CpG Рестриктаза GsaI - межгенный CpG-островок 13q32.1 Рестриктаза AvrII - 12q CpG
Скрининг дифференциального метилирования: нормальные и опухолевые метилотипы интронный-CpG- островок CUX1 ZBTB4-3-CpG Х-сцепленный IQSEC2 – 5-CpG C12orf32- 5-CpG FOXM1-5-CpG ANK3- 5-CpG
В каждом из образцов опухолевых тканей показано аномальное метилирование по крайней мере одного из 30 проанализированных CpG-островков. Ген (локус)Частота метилирования при РМЖ, % Частота метилирования в условно нормальных образцах молочной железы, % Наличие метилирования в клетках Jurkat ANK300+ ATP2B EST CN C2CD230+ AX AK TMEM176A120- TMEM176B100- FOXM170- C12orf3220- KIAA1324L100- ITGA970- Межгенный CpG-островок (13q32.1) 80-
Клинико-генетические ассоциации
Поиск и характеристика дифференциально метилированных промоторных и др. CpG- островков Характеристика особенностей метилирования различных структурно-функциональных элементов генома Скрининг аномального метилирования в диагностике, в т.ч. ранней. Области применения
Благодарности Стрельников Владимир Викторович, к.б.н., в.н.с. Танас Александр Сергеевич, н.с. Кузнецова Екатерина Борисовна, к.б.н, ст.н.с. Спасибо за внимание !
Определение метилирования одного локуса методом метилчувствительной ПЦР М – маркер молекулярной массы ДНК О – отрицательный контроль ПЦР (H 2 O) П – положительный контроль ПЦР (ДНК) о – гидролизованная ДНК из тканей опухолей н - гидролизованная ДНК из прилежащих нормальных тканей
Определение метилирования методом мультилокусной метилчувствительной ПЦР N33, CD44, GSTP, RASSF1, GPX3, SFRP – анализируемые гены НВВ – внутренний контроль ПЦР
Полная репрезентация АИМС in vitro и in silico
Анализ метилирования ДНК из клеток линии Jurkat, культивированных в присутствии 5-Aza-dc
Области приложения разработанного программного обеспечения Дизайн и анализ результатов экспериментов: - АИМС - амплификации неметилированных Alu- повторов - количественного анализа совокупного геномного метилирования Alu-повторов - детекции экстраметилированных сайтов - детекции экстранеметилированных сайтов Анализ результатов фрагментного анализа
Дизайн эксперимента с помощью программы AIMS in silico рестриктаз удлинителей праймеров, дискриминирующих различные геномные элементы, например, CpG-островки или рассеянные повторы. удлинителей праймеров, ограничивающих количество ожидаемых продуктов АИМС до значений, приемлемых при анализе капиллярным электрофорезом. Выбор:
Дифференциально метилированный участок интрона 1 гена ATP2B4 расположен в окне открытого хроматина.