Лекция 10 Производные мезодермы позвоночных животных.

Мезодерма и её производные

Хорда - производное хордомезодермы (основная составляющая организатора) - закладывается в виде плотного тяжа клеток. У позвоночных - временный орган, необходимый для индукции нервной трубки и установления передне-задней оси. У беспозвоночных хордовых- это опорный осевой орган («струна»)

По бокам нервной трубки (ниже) в передне-заднем направлении закладывются два тяжа «сегментационной пластинки» (птицы), или несегментированной (пресомитической) параксиальной мезодермы (млекопитающие).

Сомитогенез. Важнейшие составляющие сомитогенеза: периодичность обособления сомитомеров (в передне-заднем направлении) эпителизация сомитомеров, спецификация и дифференцировка компонентов сомитов

Образование сомитов куриного зародыша коррелирует с волновой активацией экспрессии генов семейства hairy. Сегментация осуществляется через равные интервалы времени (молекулярные часы), обусловливаемые периодической активностью вдоль продольной оси сигнальной системы Delta/Notch и активацией на границе сегмента сигналинга Ephrin/Eph. Тёмный цвет - районы активности с-hairy, контролируемые Delta/Notch

Образование сомитов и их эпителизация. Роль сигнальной системы Ephrin-Eph (рецептор эфрина) в отделении сомитомеров. Значение фибронектина и N-кадгерина в возникновении прочных контактов между клетками сомитомеров. Paraxis коррелирует с эпителизацией сомитомеров после отделения и превращении их в сомиты

Нарушения сомитогенеза рыбки Danio, вызванное угнетением бокового сигналинга вида Эфрин (Ephrin)-Эфриновый рецептор (Eph). Инъекции с одной из сторон (справа) несегментированной пластинки параксиальной мезодермы доминантно-негативой формы Eph, либо растворимой формы Ephrin ведут: A - к утрате границ сегментации (справа); B - к утрате экспрессии MyoD (справа)

Мезодерма сегментационной пластинки уже детерминирована в позиционном отношении вдоль передне-задней (A/P) оси. Участок сегментационной пластинки торакального отдела после пересадки в шейный отдел другого куриного зародыша индуцирует ребра, не свойственные шейному отделу

Совпадение границ экспрессии Hox-генов вдоль передне-задней оси у зародышей курицы и мыши

Паракринные факторы, участвующие в паттернировании сомитов

Дифференцировка сомитов и роль в этом процессе транскрипционных и паракринных факторов

Диаграмма, представляющая дифференцировку сомитов куриного зародыша (склеротом, дермамиотом и затем миотом и дерматом) эпителиально- мезенхимальными переходами в их структуре

Производные дермамиотома зародыша мыши

Миогенез. Формирование скелетной мускулатуры, роль паракринных факторов, молекул клеточной адгезии и специфических протеаз. Смена типов мышечных структур кореллирует с выходом клеток из пролиферации и переходом к необратимой дифференцировке

Сохранение популяции стволовых мышечных клеток в ходе миогенеза

Паракринные факторы, участвующие в паттернировании сомитов

Реализация программы мышечной дифференцировки генами селекторного типа MyoD/Myf5. MyoD-семейство - миогенных basicHLH транскрипционных факторов (частичное перекрывание функций). Транскрипционные факторы семейства MEF2 как кофакторы. Участие MyoD-генов в других программах ( в производных клеток дермамиотомов)

Конкурентные взаимоотношения между циклин-зависимой киназой (cdk4) и MyoD определяют переключение клеток с пролиферации на дифференцировку по мышечному типу

Идентификация первого миогенного транскрипционного фактора MyoD (схема экспериментов) путём вычитательной гибридизации с использованием эмбриональных фибробластоподобных клеток мыши 10T1/2 (недиференцированных и дифференцированных по мышечному типу).

Доказательства функциональной активности клонированного MyoD

Конкретные роли транскрипционных факторов мышечной дифференцировки на различных её этапах (цепочки MyoD/Myf5- myogenin-Mrf4)

Локализация различных районов мезодермы

Формирование конечностей позвоночных

Кости конечности позвоночного. Расположение костей в скелете куриного крыла (стилоподий, зигоподий, аутоподий), направления осей роста конечности (передне-задняя, дорсо-вентральная, проксимо-дистальная)

Морфогенетическое поле конечности амфибии

Доказательство того, что зачаток конечности позвоночного предопределен как независимое морфогенетическое поле до морфологического проявления признаков конечности. Пересадка ранней почки конечности Ambystoma tigrinum зародышу амфибии родственного вида индуцирует эктопическую конечность

Регуляционные возможности поля конечности амфибии

Позиции зачатков конечностей коррелируют с передне-задним паттерном экспрессии Hox-генов. Расположение зачатков передних конечностей совпадает с передними границами экспрессии Hoxc6 и Hoxb8; Hoxa10 и Hoxd10 – контролируют развитие задних конечностей

Формирование зачатка конечности начинается с контактов между эпителиальными клетками эпидермиса, выселяющимися мезенхимными клетками мезодермы боковой пластинки (предшественниками скелета), мигрирующими клетками митомов (предшественниками скелетной мускулатуры) и клетками нервного гребня (будущая соединительная ткань)

Индукция ранних зачатков конечностей паракринными факторами семейства FGF (FGF10). Слева -локализация сигналов FGF10 в мезодерме боковой пластинки в норме, справа -индукция эктопической конечности генно-инженерной конструкцией, экспрессирующей ген fgf10. Концентрирование FGF10 в области передних конечностей обеспечивает действие Wnt2b, в области задних- Wnt8c

Апикальный эктодермальный гребень - АЭГ(AER)

Распределение транскрипционных факторов Tbx 5 и Tbx4 в мезодерме вдоль передне - задней оси куриного зародыша (соответственно в области передних и задних конечностей) определяет тип конечности. Экстра источник FGF10 индуцирует дополнительные конечности, вид которых определяется типом белков Tbx (Tbx 5 или Tbx4). Tbx5-передняя конечность, Tbx4 -задняя.

Распределение транскрипционных факторов Tbx 5 и Tbx4 в мезодерме вдоль передне -задней оси зародыша мыши определяет тип формируемой конечности. Экстра источник FGF10 индуцирует дополнительные конечности (тип которых определяется видом Tbx). Сомиты вдоль оси куриного зародыша визулизированы по экспрессии MRF4. На перекрывании границ экспрессии Tbx5 и Tbx4- формируется гибридная конечность - крыло-нога

Переопределение типа формирующейся конечности при смене вида экспрессирующегося Tbx в мезодерме почки эктопической конечности куриного зародыша

Формирование проксимо-дистальной оси конечности. Апикальный эктодермальный гребень - АЭГ(AER)

В ответ на индуцирующие воздействия из мезодермы в виде паракринного фактора FGF10 - АЭГ продуцирует FGF8, действие которого на мезодерму выражается в формирование в ней зоны прогресса (транзитной зоны) - района пролиферативной активности клеток мезодермы, обусловливающий рост конечности

Эпителиально-мезенхимные индукционные взаимодействия (между клетками эпидермиса и мезодермы) проливают свет на роль роль АЭГ в формировании дистальных структур конечности. Удаление АЭГ останавливает развитие конечности. Замена типа мезодермы вызывает регрессию АЭГ. Дополнительная порция АЭГ приводит к дупликации дистальной части конечности

Региональная специфичность дифференцировки мезенхимных клеток мезодермы. По мере роста конечности в проксимо-дистальном направлении зону прогресса покидают клетки которые перестают пролиферировать и дифференцируются последовательно в хрящевые структуры: стилоподия, зигоподия и аутоподия. Доказательства индукционной активности зоны прогресса, полученные при её трансплантациях. Пересадка ранней зоны прогресса на поздний зачаток крыла приводила к формированию дополнительных структур стилоподия и зигоподия (ulna и radius)-А; пересадка поздней зоны прогресса на ранний зачаток крыла ведёт к подавлению формирования зигоподия -B.

Активность Hox-генов вдоль проксимо-дистальной оси конечности позвоночных

Последовательное формирование составных частей конечности (стилоподия, зигоподия и аутоподия) млекопитающих определяется специфическими паттернами экспрессии Hox-генов (4-х паралогичных семейств). Hox-гены в составе кластеров экспрессируются колинеарно формирующимся частям конечности вдоль проксимо- дистальной оси. В дистальной части конечности Hox-гены специфически экспрессируются в передне-заднем направлении (формирование пястья/запястья и пальцев). Мутации Hox-генов ведут к дефектам скелета конечностей.

Поэтапное формирование конечности от проксимального к дистальному концу (в три фазы) соответствует последовательной смене специфичных паттернов экспрессии Hox-генов вдоль проксимо-дистальной оси конечности зародыша мыши. В то же время их экспрессия меняется и вдоль передне-задней оси. В первой фазе - экспрессия Hoxd9, Hoxd10 во всей почке. Во второй фазе экспрессия Hox-генов с нумерацией от 9 и больше по гнездовому (матрешечному) типу вдоль передне-задней оси, но Hoxd9 также наибольшая как на заднем, так и и переднем концах. В третьей фазе Hoxd9 инактивируется, но сохраняется передне-заднее нарастание активностей Hoxd10-Hox12 и появляется передне-заднее симметричное распределение активности Hoxa13, Hoxd13-генов.

Спецификация зачатка конечности вдоль передне-задней оси. Формирование зоны поляризующей активности - ЗПА (ZPA). ЗПА формируется на заднем конце зачатка конечности в мезодерме. При подсадке дополнительной ЭПА в передний участок зачатка конечности она индуцирует дополнительные дистальные структуры, ориентированный зеркально-симметрично по отношению к нормальной конечности.

В зоне поляризующей активности продуцируется и затем секретируется паракринный фактор Sonic Hedgehog (Shh) ( области конечностей отмечены стрелками)

Главным действующим началом ЗПА является Shh (доказано экспериментально)

Спецификация зачатка конечности вдоль передне-задней оси. Формирование зоны поляризующей активности - ЗПА (ZPA). ЗПА формируется на заднем конце зачатка передней конечности цыплёнка как источник Shh, синтез которого по-видимому, инициируется под действием Hoxd8 вдоль передне-задней оси зародыша. Shh в ЗПА активирует продукцию FGF4 в постериорной части АЭГ (который затем поддерживает активность Shh)

Формирование дорсо-вентральной оси зачатка конечности позвоночных. В эктодерме зачатка конечности дорсально активен Wnt7a, вентрально- engrailed. Кроме того, дорсально -Radical fringe- гомолог Fringe, и Lmx1 - гомолог aptreous Drosophila.

Мутация гена Wnt7a приводит к вентрализации задних поверхностей лапок у мыши (к образованию подушечек пальцев на дорсальной стороне лапки)

Координация действий паракринных факторов вдоль трёх осей зачатка конечности в ходе развития

Эндохондральная оссификация на примере образования трубчатой кости конечности. По завершении образования хрящевых структур, индуцируемых паракринными факторами семейства BMP, конечностей происходит образование костей (в т.ч. трубчатых костей). Формирование хрящевой ткани и замещение её костной. Важность молекул клеточной адгезии, факторов транскрипции SOX9 и CBFA1, а также типов белков внеклеточного матрикса для процесса хондрогенеза. Кальцификация хондроцитов. Важность циркуляции крови и апоптоза для оссификации.

Пример внутримембранной оссификации. Важность транскрипционного фактора CBFA1 клеток нервного гребня, индуцируемых к оссификации паракринными факторами семейства BMP

Роль BMP2,7-паракринных факторов в индукции апоптоза, формирующего куриную лапку. А-введение дефектных аналогов рецептора BMP (справа) предотвращает апоптоз и образование пальцев, способствует сохранению перепонок. B- Экспрессия noggin, блокирующего апоптотическое действие BMP, строго соответствует районам пальцев конечности. Хондрогенез в фалангах пальцев либо был уже инициирован, либо прошел.

Виды гибели клеток

Апоптоз -программированная клеточная смерть 1. Морфологические характеристики (отличия от некроза) 2. Исполнители - сериновые протеазы, специфичные к аспарагину (каспазы); протеаза-зависимая ДНК-аза (CAD) 3. Специфика (каспазы эффекторные и инициаторные, их число у разных видов) 4. Консерватизм основных путей апоптоза 5. Консерватизм доменов белков, участвующих в апоптозе

Роль апоптоза в процессе онтогенеза и эмбриогенеза. Апоптоз играет жизненно важную роль в процессе эмбрионального и онтогенетического развития. Он наблюдается при различных морфогенетических процессах. Хорошо исследована апоптотическая гибель клеток при эмбриональном развитии беспозвоночных животных, например нематоды (Chaenorhabditis elegans). Запрограммированная клеточная гибель наблюдается при метаморфозе насекомых. Изучена также запрограммированная клеточная гибель в процессе эмбриогенеза высших позвоночных - при развитии глаза млекопитающих, сердца, нервной системы, конечностей. Нарушение апоптоза в эмбриогенезе может приводить к внутриутробной гибели плода, врожденным уродствам или различным заболеваниям, в том числе и злокачественным новообразованиям.

Роль BMP-факторов и gremlin (аналога noggin) в формирования пальцев конечности позвоночных. Апоптоз проходит в коже, но не в фалангах. В фалангах апоптоз блокирован (угнетение BMP гремлином). Различия в дистальной части конечностей утки и курицы объясняется разницей в характере апоптоза в этой области.

Участие BMP в стабилизации хряща и в формировании суставов. Экспрессия BMP7 (A), BMP2 на срезах куриных пальцев III и IV в ходе формирования конечности. Звездочками, стрелками отмечены районы формирования суставов. С и D- Действие noggin на активность BMP. C- норма (экспрессия -синяя окраска), D- мутация noggin приводит к нарушениям апоптоза

Chick Hindlimb Duck Hindlimb BMP GremlinApoptosisNewborn HOW THE DUCK GOT ITS WEBBED FEET Merino et al., Dev. Biol. 200:

HOW THE DUCK GOT ITS WEBBED FEET. II. Experimental Manipulation of Chick Feet Untreated Chick Hindlimb Chick Hindlimb Treated with Gremlin-Containing Bead in Interdigital Space