Таргетная нанотерапия глиом Всероссийский конкурс инновационных проектов 2011 Нуколова Наталия Владимировна Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова

Мультиформная глиобластома В структуре нейроонкологических заболеваний % принадлежит низкодифференцированным глиомам. Самая злокачественная из них мультиформная глиобластома характеризуется быстрым неконтролируемым ростом, высокой частотой послеоперационных рецидивов. Cредняя выживаемость пациентов с глиобластомой составляет около года с момента постановки диагноза [Stewart L.A., 2002, Zalutsky M.R, 2005].

МикроРНК miR-21 и глиома МикроРНК играют важную роль в онкогенезе, включая развитие опухолей мозга. Уровнь экспрессии различных микроРНК значительно выше в опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой. Экспрессия микроРНК miR-21 существенно повышена в девяти видах опухолей, включая мультиформную глиобластому и другие типы глиом. МикроРНК miR-21 обладает мощным стимулирующим действием, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток глиом. Подавление экспрессии микроРНК miR-21 в тканях глиомы, должно существенно снижать пролиферативный и инвазивный потенциал опухолевых клеток, а также усиливать их чувствительность к противораковой терапии.

Биогенез микроРНК miR-21 Natsume et al siRNA Анти-miR-21

microRNAОпухольМишеньЭффект на опухоль Ссылка miR-10bГлиома (High grade и low grade) Ингибирует: BCL2L11/Bim, TFAP2C/AP-2γ, CDKN1A/p21, CDKN2A/p16 Стимулирует рост и пролиферацию Gabriely et al. 2011; Cancer Res.,71(10): miR-21Глиома (grade II - IV) Ингибирует: Spry2, PTEN, TP53, APAF, TGFβ,bcl-2, тропомиозин-1 Активирует инвазию, рост, пролиферацию ингибирует апоптоз Kwak et al. Oncogene. 2011; 30(21): miR-221Мульти - форменная глиобластома Ингибирует: BIRC1 Активирует: BIRC5, каспаза-3 Стимулирует выживание клеток, ингибируя апоптоз Lukiw et al. J Neurooncol. 2009; 91(1): miR-93Человеческая глиома линии U87 Ингибирование интегрина-β8 Активирует рост и ангиогенез Fang et al. Oncogene. 2011; 30(7):

Взаимодействие микроРНК с онкогенными сигнальными механизмами в глиомах Silber et al. 2009

Цель проекта В настоящем проекте предлагается подавить экспрессию микроРНК miR-21 в клетках глиомы путем адресной доставки терапевтического агента - смеси олигонуклеотидов, способных подавлять экспрессию miR-21, непосредственно в опухолевые клетки.

Задачи исследования Создание векторного наноконтейнера (иммунолипосом) для адресной доставки терапевтического агента в глиому. Загрузка иммунолипосом терапевтическим агентом: смесь олигонуклеотида, имеющий антисмыслую последовательность (анти-miR-21) к данной микроРНК, а также малая интерферирующая РНК (siRNA), специфически подаляющая синтез первичной РНК-предшественника miR-21. Оценка эффекта противопухолевого действия данной системы на первичных клеточных культурах глиобластомы человека (U87 или U251). Оценка эффективности комбинированной терапии иммунолипосомами и противораковым лекарством (антимитотическим агентом таксолом или моноклональными антителами против VEGF (авастином)) in vitro

Методы решения задач: синтез Синтез иммунолипосом: наночастицы, несущие на своей поверхности ковалентно связанные нейроспецифические моноклональные антитела против коннексина-43 (Сх43) в качестве векторных групп. экспрессия поверхностного белка Сх43 по периферии глиомы существенно повышена в связи с тем, что Сх43 необходим для формирования плотных межклеточных контактов между опухолевыми и неопухолевыми клетками и активной миграции по перивазальным и периневральным путям. Высокая экспрессия коннексина 43 в активно мигрирующих глиомных клетках должна гарантировать крайне селективную доставку наноконтейнеров, коньюгированных с антителами против Сх43 Оценка стабильности систем, их размера, заряда и полидисперсности. Оценка степени загрузки терапевтическим агентом

фатидил CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C C O H 3 C H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 3 C O CH O O H 2 C H C CH 2 O P O OO CH 2 C H 2 NH 3 стеарои CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C C O H 3 C H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 2 H 2 C CH 3 C O CH O O H 2 C H C CH 2 O P O OO CH 2 C H 2 N H 3 C CH 3 CH 3 стеароил олеил 3-фосфоглицерин холин фос л олеил 3-фосфоглицерин этаноламин фосфатидил Фосфатидилэтаноламин Фосфатидилхолин H 2 C CH CH 2 C C H 2 C CH CH 2 CH CH C H 2 C H 2 C CH 2 CH 2 CH OH H 3 C H 3 C CH H 3 C CH 2 H 2 C CH 2 CH H 3 C CH 3 Холестерин Гидрофобный хвост Гидрофльная голова Создание липосомальных систем

PEG Моноклональные антитела к Сх43 Векторные липосомы с загруженным терапевтическим препаратом

Анализ векторной иммунолипосомальной системы с загруженным терапевтическим агентом (Анти-miR-21 и siRNA) 1) подбор параметров для сохранения иммунохимической активности векторных групп (иммуноферментный анализ) 2) подбор условий для получения наноконтейнеров с максимальной степенью загрузки терапевтическим агентом 3) анализ сохранения/высвобождения Анти-miR-21 и siRNA Методы решения задач: анализ Конкурентный ИФА Электрофорез

Оценка эффекта противоопухолевого действия данной системы на первичных клеточных культурах глиобластомы человека (U87 или U251) После связывания иммунолипосомы с клеткой-мишенью ее содержимое (анти-miR-21 и siRNA) будет попадать в цитоплазму опухолевой клетки и активироваться внутриклеточной эндонуклеазой DICER, участвующей в естественном процессе перехода предшественников микроРНК в зрелые микроРНК. Анти-miR-21, будучи превращена в одноцепочечную активную форму, будет комплементарно связываться со зрелой miR-21 в цитоплазме и тем самым инактивировать ее. SiRNA будет специфически связываться с РНК предшественником miR-21 и способствовать ее последующей деградации. Методы решения задач: in vitro

Воспроизведение модели экспериментальной глиомы на животных с помощью стереотаксической имплантации в стриатум предварительно кльтивированных клеток глиомы Сравнительная оценка эффективности действия загруженных иммунолипосом, модифицированных нейроспецифическими и неспецифическими антителами, in vivo Исследование противоопухолевой активности, токсичности препаратов, а также средней продолжительности жизни экспериментальных животных с глиомой. Методы решения задач: in vivo в случае положительного результата на культурах опухолевых клеток

Ожидаемые результаты Препарат иммунолипосомальных наночастиц, загруженных олигонуклеотидами для специфического подавления экспрессии онкомикроРНК miR-21, и коньюгированных с моноклональными антителами к коннексину-43 специфическое подавление роста и пролиферации клеток глиом адресная доставка к опухолевым клеткам снижение радио- и хемоустойчивости глиом лечение глиом