Видовая идентификация бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК, роль и место метода в диагностике бактериальных инфекций Выполнила: Савельева Ксения, Выполнила: Савельева Ксения, ученица 11 специализированного класса ученица 11 специализированного класса МБОУ Краснообской СОШ 1 МБОУ Краснообской СОШ 1 Научный руководитель: Научный руководитель: канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич канд. биол. наук Афонюшкин Василий Николаевич

Задачи: 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 1. Освоить метод электрофореза ДНК в геле агарозы 2. Освоить метод анализа результатов секвенирования и провести построение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16 S рибосомальной РНК полученных изолятов рода Bacillus 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий 3. Изучить перспективы совместного использования методов секвенирования и биохимической идентификации бактерий Цель исследования: Изучить возможности метода видовой идентификации бактерий методом секвенирования гена 16S рибосомальной РНК в сочетании с традиционными методами идентификации

материалы и методы Чистые культуры изолятов высевали на МПА и после часов инкубации готовили бактериальную взвесь на фосфатно-солевом буфере. Культуры окрашивали по Грамму и микроскопировали. Оценивали следующие биохимические свойства: Утилизация цитрата, малоната, глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, фенилаланина, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарабинола (Реакция Фогес- Проскауэра), наличие бета-галактозидазы, уреазы, декарбоксилаз аргинина и лизина, гидролазы аргинина. Культуры тестировали на каталазную, цитохромоксидазную активности, образование нитритов, синтез пигментов, антибиотикорезистентность, изучали культуральные и морфологические свойства. Бетта-галактозидазную, тритофандезаминазную и глюкоронидазную активности проверяли на среде Уриселект 4 (BioRad).ДНК выделяли фенолхлороформенным методом, вид определяли на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНКи межгенного спейсера 16-23S рибосомальной РНК и совокупности биохимических, культурных и морфологических признаков.

Культуральные свойства: выросшие культуры не росли на среде Эндо т.е. не относились к энтеробактериям, росли на мясопептонном агаре а аэробных условиях при 37С Тинкториальные свойства: выросшие культуры исследовали микроскопически и окрашивали по Граму, что позволило установить что полученные культуры относятся к спорообразующим Гр+ палочкам Характеристики культур

Схема исследований: из выросших культур выделяли ДНК и ставили ПЦР с универсальными праймерами, в результате мы амплифицировали фрагмент гена 16S рибосомальной РНК

Раствор с праймером распределяют по 4 пробиркам, в каждой из которых находятся 4 дезоксинуклеотида dАТР,dСТР, dТТР(один из них –меченный радиоктивным изотопом) и один из четырех 2;3- дидезоксинуклеотидов(ddАТР,ddТТР,ddGTP,dd СТР) Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигнуклеотидов разной длины, включающих праймеровую последовательность. Далее в пробирки добавляют формалид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриловом геле на четерых дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть»нуклеиновую последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул белков и нуклеиновых кислот (а также их фрагментов). Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.белковнуклеиновых кислот Электрофорез это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля.электрокинетическое явлениеэлектрического поляЭлектрофорез Схема исследований: продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в агарозном геле. Метод Сэнгера

Результаты собственных исследований Рис.1 Результаты капиллярного электрофореза фрагмента гена 16 S рибосомальной РНК

Рис. 2 филогенетическое дерево построенное на основании результатов выравнивания фрагмента гена 16S рибосомальной РНК

Результаты собственных исследований Рис. 3 Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей

Результаты биохимических исследований культур с использованием тестов ПБДЭ Биохимические свойства штамма B.licheniformis: утилизация цитрат отрицательно, малонат отрицательно, цитрат натрия +глюкоза отрицательно, лизин отрицательно, аргинин отрицательно, орнитин отрицательно, фенилаланин отрицательно, индол отрицательно, ацетилметилкарабинол положительно уреаза отрицательно, сероводород отрицательно, глюкоза положительно, б-галактозидаза положительно, лактоза отрицательно, манит положительно, сахароза положительно, инозит положительно, сорбит положительно, мальтоза положительно

Заключение Видовая идентификация микроорганизмов на основе секвенирования может являться «золотым стандартом» лабораторной диагностики, однако точность метода ограничена достоверностью и полнотой баз данных GenBank и, следовательно, требует дополнительного использования подтверждающих тестов.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!