4. Ингибирование ферментативных реакций. Методы описания и определения констант ингибирования. Применение элементов теории графов для вывода кинетических уравнений в стационарном режиме Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 4. Ингибирование ферментативных реакций. Методы описания и определения констант ингибирования. Применение элементов теории графов для вывода кинетических уравнений в стационарном режиме

Cкорость ферментативной реакции Взаимодействуя с ферментом, ингибиторы по тому или иному механизму тормозят катализ, и, таким образом, уменьшают скорость ферментативной реакции. vАктиваторы стимулируют каталитическую активность ферментов vИнгибиторы подавляют каталитическую активность ферментов

Разрушение фермента Ингибитор Различные факторы (высокие температуры, кислоты) =

Природные ингибиторы – продукты биохимической цепи Малонат Сукцинат Фумарат Ингибитор

Аллостерическое (от греч. "инопространственный") ингибирование В процессе окисления глюкозы происходит фосфорилирование АDР АТР, для накопления энергетических запасов клетки в виде АТР. При накоплении в системе достаточного количества АТР процесс целесообразно притормозить: Фруктозо-6-фосфатФруктозо-1,6-дифосфат АТР АDP

Аллостерическое (от греч. "инопространственный") ингибирование Каталитический центр Аллостерический центр АТР Фосфорилирование Ингибирование фосфорилирования

Связывание ингибитора с ферментом Обратимое Необратимое

Обратимое связывание ингибитора с ферментом

Необратимое связывание ингибитора с ферментом

Пример о братимого ингибитора Обратимые ингибиторы, как правило – аналоги субстратов. Например, аналог субстрата: узнается панкреатической рибонуклеазой, но фермент не гидролизует такой субстрат, образуя стабильный комплекс. В – пиримидиновое основание.

Типы ингибирования 1.Конкурентное ингибирование, 2.Неконкурентное ингибирование, 3.Бесконкурентное ингибирование, 4.Смешанное ингибирование. k 1,, k 2,, k 3, k 4, k -1, k -2, k -3, k -4 – константы скорости соответствующих реакций, K S, K S ', K I, K I ' – константы диссоциации комплексов фермента с субстратом и/или ингибитором, γ, γ', δ – численные коэффициенты. Рассмотрен случай k β = 0, то есть когда тройной комплекс ESI не распадается с образованием продукта. При этом скорость реакции образования продукта равна: v = k α [ES] v = k α [ES] (при [S] 0, [I] 0 >> [E] 0 ).

Конкурентное ингибирование (δ = γ = 0) V =

Неконкурентное ингибирование (δ = γ = 1, K S = K S ', K I = K I ') V =

Смешанное ингибирование (δ = γ 1, K S K S ', K I K I ') V =

Бесконкурентное ингибирование (δ = γ' = 0) V =

Графические методы определения кинетических параметров реакции в присутствии ингибитора На приведенных ниже схематически изображенных графиках: V – максимальная скорость реакции, К – эффективная константа, полученная экспериментально, K I – константа ингибирования; а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование.

Метод Лайнуивера-Берка Метод Лайнуивера-Берка 1/v (1/[S]) I 2 > I 1, -1/K = -1/K M (1+[I]/K I ) а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование - I=0

Метод Эди-Хофсти Метод Эди-Хофсти v (v/[S]) I 2 > I 1, tg α = -K = -K M (1+[I]/K I ) а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование - I=0

Метод Диксона Метод Диксона 1/v ([I]) S 2 > S 1 а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование

Метод Корниш-Боуден Метод Корниш-Боуден [S]/v ([I]) S 2 > S 1 а - конкурентное, б - неконкурентное, в - смешанное, г - бесконкурентное ингибирование

Теория графов Граф Эйлера, 1736 г. A A D B C Задача, положившая начало развитию теории графов: как пройти по всем семи мостам, не проходя ни по одному дважды. Теорема Эйлера: если сеть имеет не более двух «странных» (с нечетным количеством связей) вершин, есть по крайней мере один подобный путь. Леонард Эйлер Швейцарский и российский математик A B D C

Теория графов Задача: пройти через все вершины по одному разу (номера вершин указывают последовательность шагов, прохождение каждого ребра не обязательно). Граф Гамильтона, 1859 г. Уильям Роуэн Гамильтон Ирландский математик и физик

Граф – это схематическое изображение некоторого множества элементов и их взаимосвязей. Граф состоит из вершин – узлов и соединяющих их линий. В применении к ферментативной кинетике узлам сопоставляются ферментные формы. Ветви графа – линии, соединяющие узлы, имеют направление. Ветвям графа сопоставляются элементарные стадии ферментативной реакции. Вес ветви – число, характеризующее ветвь графа, эквивалентно константе скорости реакции. Путь графа – непрерывная совокупность ветвей, в которой ни одна из вершин не встречается более одного раза, не замкнутая (не должно быть циклов). База – одна из вершин. Базовое дерево – совокупность ветвей, проходящих через все узлы и ведущих к базе. Определитель узла (базы) (D) – сумма величин (базовых) деревьев. Скорость ферментативной реакции можно выразить формулой: v = E 0, где k r – константа скорости реакции, приводящей к образованию продукта. Теория графов

Теория графов. Пример 1: односубстратная ферментативная реакция Граф: k r = k 2 Вес параллельных ветвей, ведущих от узла ES к узлу E, складывается: D r = D ES = k 1 S D E = k -1 + k 2 v = E 0

Теория графов. Пример 2: конкурентное ингибирование Определители (D i ) и их деревья: D ES = k -i k 1 S D EI = k -1 k i I + k i Ik 2 D E = k -i k -1 + k -i k 2 Граф: v = E 0 Здесь константа ингибирования, а

Теория графов. Пример 3: бесконкурентное ингибирование Определители (D i ) и их деревья: D ES = k -i k 1 S D ESI = k -1 k i I + k i Ik 2 D E = k -i k -1 + k -i k 2 Граф: v = E 0