Лекция 6 ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ

Рис.. Введение фрагмента рекомбинантной молекулы ДНК в плазмидный вектор pSC101 с помощью рестриктазы EcoRI, образующей «липкие» концы с последующим внедрением рекомбинантной плазмиды в бактерию кишечная палочка (E. coli) для клонирования (размножения) нужного гена.

Устойчивость растений к гербицидам В настоящее время в сельском хозяйстве широко используют гербициды химические соединения, применяемые для уничтожения сорной растительности. Гербициды широкого спектра действия могут не только уничтожать сорняки, но и угнетать рост культурных растений. В связи с этим возникает необходимость в создании растений, устойчивых к этим веществам. Существует два подхода к решению этой проблемы: прямая селекция устойчивых к гербицидам мутантных форм растений, или мутантных клеточных штаммов (клеточная селекция), и генно-инженерный метод, который состоит во введении в растения генов гербицид-резистентности растительного или бактериального происхождения.

Изучая механизмы действия гербицидов, генетики выяснили, что чаще всего они действуют на какой либо один важный для растения фермент, прикрепляются к нему и тем самым ослабляют его работу. Это приводит к нарушению роста и развития растений, и они погибают. Установлено, что толе - рантность к гербицидам обусловлена мутацией одного гена. Основной механизм устойчивости связан с изменением последовательности аминокислот в той части молекулы фермента, в которой происходит его связывание с гербици - дом. В результате гербицид не узнает свою «мишень» в структуре фермента, последний сохраняет свою функцио - нальную активность, а организм становится толерантным к действию гербицида. Описанный механизм получил название «мутация мишени» и характерен для устойчивости к таким гербицидам, как Раундап (глифосат), сульфанилтиомочевина и др.

Гербицид глифосат относится к гербицидам общего дей - ствия. Его мишенью в растении является фермент EPSPS (енолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза), который играет важную роль в синтезе ароматических аминокис - лот. Под действием глифосата неустойчивые к нему растения из-за недостатка ароматических аминокислот погибают в тече - ние двух недель. Необходимо подчеркнуть, что глифосат не несет опасности для животных и человека, так как его «мишень» EPSPS имеется только у растений, грибов и бактерий.

В результате генетических исследований были обнаружены бактерии, у которых из-за точковой мутации произошла замена одной аминокислоты в области фермента EPSPS, где проис - ходит его связывание с гербицидом глифосатом. Поэтому герби - цид не может дезактивировать такой мутантный фермент, и бактерии устойчивы к его действию. В настоящее время выделены гены EPSPS с мутацией мишени от бактерий рода Agrobacterium (ген cp4), Salmonella (ген sm1) и др. Например, в более чем 1000 полученных трансгенных сортах сои, устойчивых к глифосату, встроен мутантный ген cp4 от почвенной бактерии Agrobacterium tumefascens. Для доставки гена EPSPS к хлоропластам (месту синтеза ароматических аминокислот) к нему присоединен фрагмент ДНК от петунии, кодирующий небольшой транзитный пептид. Таким образом, генетически модифицированные сорта сои отличаются от обычных тем, что у них фермент EPSPS, привне - сенный от гена бактерии, не связывается с гербицидом, что делает эти сорта устойчивыми к глифосату. Хлоропластный транзитный пептид от петунии быстро разрушается в процессе переваривания и также не несет опасности для организма животных и человека

Устойчивость растений к насекомым Еще в 30е годы ХХ века было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтези­руют специфический белок так называе-мый Bt-протеин (Bt-токсин, дельта-эндотоксин) высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщеп­ляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Необходимо отметить, что Bt-протеин, выделенный из одного определенного штамма бактерии, способен убивать только определенный тип насекомых, например, жуков, и не действует на пчел, бабочек и др. Поэтому препараты, широко используемые в сельском и лесном хозяйстве для борьбы с различными насекомыми-вредителями в соответствии со спектром действия носят названия колептерин, лепидоцид, дендролин и др. Еще одним важным достоинством этих препаратов является их полная безопасность для здоровья как теплокровных и человека (пищеварительная система у них устроена иначе, чем у насекомых), так и для окружающей среды (высокая специфичность действия, быстро разрушаются под действием ультрафиолета, не способны накапливаться в растениях и почве, легко смываются с листьев). Однако, Bt-препараты способны защищать растения только очень короткое время и поэтому слабоэффективны.

Рисунок Схематическое изображение кассеты гена из сои Roundup ReadyR (модифицировано из Padgette et al, 1995)

Рисунок. Схематическое изображение конструкции гена cryIA (b) из плазмиды PV-ZMBK07, используемой при трансформации MON810, включая CaMV 35S промотор, HSP70 интрон 1 кукурузы и синтетический ген д-эндотоксина cryIA(b), за которым следует nos терминатор (модифицированный из BATS, 2003).

При создании трансгенной сои в растение вводится нужный ген, к которому для усиления активности присоединяется сильный промотор 35S взятый от вируса табачной мозаики. Поскольку нуклеотидная последовательность 35S промотора установлена, генетики разработали метод ПЦР-анализа позволяющий, с использованием целевых праймеров амплифицировать фрагмент промотора величиной 194 н.п. Таким образом, если при ПЦР-анализе продуктов, содержащих сою, в них обнаружен фрагмент ДНК величиной 194 н.п. это указывает на наличие в образце генетически модифицированной сои. В ходе электрофореза в агарозном геле фрагмент ДНК промотора 35S величиной 194 н. п. легко отделяется от также амплифицированного маркерного фрагмента ДНК чистой сои величиной 400 н.п..Ниже представлен электрофоретический спектр фрагментов ДНК, после амплификации с целевыми праймерами 5 образцов (дорожки 3-7), содержащих соевые компоненты (рис. 4). Определите в каких образцах содержится генетически модифицированная соя? Рис. 4 – Электрофореграмма спектра ДНК-фрагментов: 1 – фрагмент ДНК чистой сои, 2 – фрагмент ДНК 35S промотора, 3-7 – фрагментов ДНК из образцов, содержащих сою. 400 н.п. 194 н.п

Рис. 5 – Электрофореграмма спектра фрагментов ДНК из образцов кукурузной муки: 1 – фрагмент ДНК чистой кукурузы, 2 – фрагмент ДНК 35S промотора, 3-7 – образцы содержащие кукурузу. В ходе создания трансгенной куурузы в растение вводится нужный ген, к которому для усиления активности присоединяется промотор 35S взятый от вируса. Молекулярные генетики установили нуклеотидную последовательность 35S промотора и разработали метод ПЦР-анализа позволяющий амплифицировать фрагмент промотора величиной 194 н.п. Поэтому, если при ПЦР-анализе продуктов, содержащих кукурузу, в них обнаружен фрагмент ДНК величиной 194 н.п. это указывает на наличие в образце трансгенной кукурузы. В ходе электрофореза в агарозном геле фрагмент ДНК промотора 35S величиной 194 н. п. легко отделяется от также амплифицированного маркерного фрагмента ДНК кукурузы величиной 544 н.п..Ниже представлен электрофоретический спектр фрагментов ДНК, после амплификации с целевыми праймерами 5 образцов (дорожки 3-7) содержащих кукурузную муку (рис. 5). Определите, в каких образцах содержится генетически модифицированная кукуруза? 544 н.п. 194 н.п

Рис. 6 – Электрофореграмма спектра фрагментов ДНК из образцов содержащих соевые и кукурузные компоненты: 1 – фрагмент ДНК чистой кукурузы, 2 – фрагмент ДНК чистой сои, 3 – фрагмент ДНК 35S промотора, 4-11 – образцы содержащие кукурузу и сою, 12 – маркеры определенной величины ДНК. Ниже представлен электрофоретический спектр фрагментов ДНК, после амплификации продуктов, содержащих соевые и кукурузные компоненты (дорожки 4-11). Укажите, в каких продуктах представлены кукурузные компоненты, а в каких соевые? Какие из них генетически модифицированы? Определите какую величину имеют фрагменты ДНК в образцах 1-11? 500 н.п. 100 н.п н.п. 300 н.п.