ПРОВЕРКА МОДЕЛИ УОТСОНА И КРИКА План 1. Полуконсервативная репликация

Модель двойной спирали ДНК, предложенная в 1953 г., знаменовала рождение молекулярной биоло- гии. Лишь через пять лет были получены первые экспериментальные подтверждения модели Уотсона- Крика. В экспериментах Мэтью Мезелсона и Франклина Сталя было показано, что в точном соответствии с предсказаниями модели, репликация ДНК происходит полуконсервативно: каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной цепи, полученной от родительской двойной спирали (консервативной цепи), и одной вновь синтезированной цепи (рис.1).

Чтобы отличить дочерние мо- лекулы от родительских. выра- щивали Е.сoli на среде, со- держащей тяжёлый азота - 15 N, который включался в состав ДНК и служил меткой. Для того чтобы пометить изотопом 15 N бактериальную ДНК, дос- таточно вести культивирование на такой среде в течение двенадцати поколений. Моле- кулы, содержащие 15 N, можно отличить от молекул, содер- жащих более легкий, обычный изотоп 14 N, по плотности, так как масса ДНК с 15 N больше, чем обычной ДНК. Рис. 1. Предложенная Уотсоном и Криком модель репликации двойной спирали ДНК

Молекулы ДНК с различной плотностью разделяли цент- рифугированием в градиенте плотности хлористого цезия CsCl (рис.2). В ходе центри- фугирования молекулы ДНК собираются в том слое рас- твора, плотность которого равна их собственной плот- ности. ДНК из клеток Е.coli, выращенных на среде, содер- жащей 15 N, имеет плотность 1,724 г/см 3, тогда как ДНК из клеток, выращенных на среде с изотопом 14 N, - 1,710 г/см 3. Смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при центрифугировании. Рис. 2. Последоваельные этапы эксперимента Мезелсона и Сталя, показавшего полуконсервативный механизм репликации ДНК.

Согласно модели, ДНК в клетках второго поколения должна представлять собой гибридную двойную спираль с промежуточной плотностью, одна из цепей которой содержит только тяжелый изотоп азота (N 15 ), а другая - только легкий - 14 N. Чтобы проверить это, Мезелсон и Сталь нагревали ДНК промежуточной плотности в течение 30 мин при температуре 100°С. Ковалентные связи не разрываются, но рвутся водородные. В результате ДНК разделилась на две равные по объему фракции с разными плотностями. Плотность одной из фракций совпала с плотностью тяжелой ДНК, а другой - с плотностью легкой ДНК. Из этого было сделано заключение, что молекула ДНК промежуточной плотности, образующаяся после первого деления в легкой среде, состоит из одной родительской цепи, содержащей только тяжелый изотоп азота, и другой, вновь синтезированной дочерней цепи, с лёгким азотом, что соответствует модели Уотсона-Крика.

Аналогичные эксперименты проделывали с репли- цирующейся ДНК других прокариотических и эука- риотических организмов, и каждый раз оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты Мезелсона-Сталя были первым до- казательством справедливости модели Уотсона-Кри- ка. В настоящее время и другие основные положения этой модели убедительно подтверждены, а структура двойной спирали ДНК легла в основу современной генетики. В 1962 году Френсису Крику, Джеймсу Уотсону и Морису Уилкинсу за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и их роли в передаче наследственной информации в живой материи была присуждена Нобелевская премия.

Вопросы и задания 1. Нарисуйте схему полуконсервативной репликации следующего участка ДНК: ААААТГТЦЦААТАГГЦА ТТТТАЦАГГТТАТЦЦГТ 2. Почему в экспериментах Месельсона и Сталя после двух поколений деления клеток Е. coli в пробирке с CsCl образо- вались две фракции ДНК?