Лекция 11. Молекулярные основы генетической коррекции и генотерапии

Генная инженерия – это набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкций Задачи генной инженерии: создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов Рекомбинантные ДНК создаются для определенных научных целей

Генная инженерия является основой: биотехнологических процессов картирования хромосом секвенирования геномов коррекции генома и генотерапии

Первые рекомбинантные ДНК называли химерами (1973) Рекомбинантные ДНК состоят из фрагментов ДНК, полученных от разных организмов например, ДНК бактерии, вируса и человека

Принципы генетической инженерии Конструирование рекомбинантных молекул ДНК Перенос ДНК в клетки-реципиенты Селекция и отбор трансформированных клеток Клонирование рекомбинантной ДНК в клетках хозяина

Концепция создания рекомбинантной ДНК: вектор – вставка Вставка – это чужеродная ДНК, встроенная в вектор Вектор – это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку-хозяина с целью ее размножения и клонирования

Для вставки используют: Геномную ДНК, выделенную из клеток Гены, синтезированные in vitro Копии ДНК (кДНК), полученные с помощью фермента обратной транскриптазы на РНК-матрице

Характеристика вектора: Вектор должен содержать точку начала репликации (origin) для самостоятельной репликации в клетке- хозяине Вектор должен иметь два селективных маркера для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина

В качестве генетических векторов используют: Плазмиды Космиды (плазмиды, которые содержат cos-сайты фага ) Бактериофаги Вирусы Yac (yeast artificial chromosomes) – искусственные хромосомы дрожжей

Строение плазмидного вектора

Основные ферменты, используемые в генной инженерии: Эндонуклеазы рестрикции ДНК-лигазы Обратная транскриптаза Taq-полимераза Концевая трансфераза ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова) РНКаза Н

Рестриктаза EcoRI разрезает ДНК в палиндроме 5-G*AATTC-3 3-CTTAA* G-5

Схема строения плазмидного вектора

Схема лигирования фрагментов ДНК

Создание рекомбинанатной ДНК

Перенос рекомбинантной ДНК в клетку

Селекция трансформированных клеток

Клонирование рекомбинантной ДНК Клонирование – это получение большого количества копий определенного гена в результате его размножения в клетках в составе рекомбинантной ДНК Клон – это популяция клеток, которая берет начало от одной клетки

Трансформация – изменение свойств клетки в результате переноса рекомбинантной ДНК через мембрану Скрининг – поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди десятков тысяч клонов

Основные методы скрининга: Блоттинг -гибридизация – метод, при помощи которого ДНК-мишень спаривается с комплементарным фрагментом ДНК (зондом) Зонды – это молекулы ДНК или РНК, меченные радиоактивными изотопами Скрининг – поиск и обнаружение рекомбинантных ДНК среди тысяч клонов

Трансгенные организмы Трансгенез – перенос чужеродных генов в эмбриональные клетки организма Трансген – это чужой ген, перенесенный в новый организм посредством методов генной инженерии Для создания трансгенных животных и растений трансген должен наследоваться всеми клетками организма.

Получение трансгенных мышей методом генетичеcкой модификации эмбриональных стволовых клеток (М.Эванс, 1981 г.)

Трансгенная мышь содержит ген соматотропина крысы (1982 г.)

Генная терапия - новое направление лечения наследственных болезней человека Генная терапия – коррекция мутантных генов или нарушений клеточных функций с помощью методов генной инженерии

Трансгенные эксперименты на человеке запрещены Генотерапия основана на введении нормальной копии гена в соматические клетки костного мозга, фибробласты кожи, миобласты, гепатоциты или лимфоциты пациента Генная терапия на уровне половых и зародышевых клеток не проводится

терапевтическая генно-инженерная конструкция содержит терапевтический ген для коррекции мутантного гена подходящий вектор тканеспецифический промотор селективный маркер для отбора трансформированных клеток

Генно-инженерная конструкция для коррекции наследственного иммунодефицита LTR ADA neo ген ADA (ДНК человека) - кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы ген neo (ДНК бактерии) – контролирует устойчивость клеток к антибиотику неомицину, LTR (ДНК ретровируса) – длинные концевые повторы, содержат промотор для экспрессии терапевтического гена в лимфоцитах

Векторы, используемые в генотерапии Ретровирусы – поражают миобласты, фибробласты, гепатоциты, гематопоэтические и стволовые клетки Аденовирусы – поражают клетки слизистой оболочки дыхательных путей Аденоассоциированные вирусы - интегрируют в специфический участок 19 хр. Герпесвирусы –инфицируют нейроны и другие клетки

Генная терапия ex vivo: 1. получение от пациента клеток с генным дефектом 2. перенос терапевтической генной конструкции в изолированные клетки; 3. отбор, выращивание и тестирование трансфицированных клеток; 4. трансплантация или трансфузия трансфицированных клеток пациенту

Генная терапия in vivo: ген Х кодирует белок, корректирующий наследственный дефект ген Х доставляется в организм пациента и экспрессируется в клетках ткани Х экспрессия гена Х происходит только в ткани Х, т.к. промотор р тканеспецифичен

Микроинъекция ДНК в ткани

Метод электропорации – высокое напряжение увеличивает проницаемость мембраны

Методы доставки генно-инженерных конструкций в клетки-мишени Физические методы: Микроинъекция Электропорация с помощью аэрозолей Биологические методы : эндоцитоз липосомы нановекторы на основе желатина

Агрессивная генотерапия для коррекции онкологических заболеваний: Уничтожение опухоли - в лимфоциты переносят ген TNF (фактор некроза опухолей) с увеличенной активностью Активизация иммунной системы - инъекция в опухоль липосомно-плазмидного комплекса, который содержит ген, кодирующий синтез чужого антигена HLA-B7 Отключение кровоснабжения опухоли - в кровь вводят терапевтический ген, контролирующий синтез специального белка